卵巢癌特異性結(jié)合肽的篩選及其對卵巢癌生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的與背景:
　　卵巢癌病死率居女性生殖器三大惡性腫瘤首位，在確診時75％的患者已是FIGOIII期以上病變。發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、侵潤和化療耐藥性是卵巢癌高病死率、預(yù)后差的關(guān)鍵因素。因此，臨床上迫切需要探索卵巢癌治療及其轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)干預(yù)治療的新方法。近年來，靶向藥物輸送系統(tǒng)治療卵巢癌備受關(guān)注，但始終沒有找到高特異性、高親和力的載體。噬菌體展示技術(shù)通過確定表達(dá)在不同腫瘤細(xì)胞或組織器官上特異性分子的結(jié)合肽，并以此結(jié)合肽為載體與藥物靶向相聯(lián)，可

2、以有效地提高定向傳遞化療藥物的能力。目前國內(nèi)尚未見卵巢癌特異性結(jié)合肽的研究報道。因此，本實驗擬使用噬菌體展示文庫技術(shù)首次篩選卵巢癌細(xì)胞特異性結(jié)合肽，并通過體內(nèi)外實驗研究其對卵巢癌侵襲和轉(zhuǎn)移生物行為的影響，為卵巢癌的靶向治療提供理想的載體。
　　方法:
　　1.利用改良的細(xì)胞培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)正常卵巢上皮細(xì)胞，創(chuàng)新性地運用細(xì)胞刷刷取人卵巢表面上皮（human ovarian surface epithelium，HOSE），紅細(xì)

3、胞裂解法、差速貼壁法對細(xì)胞進(jìn)行分離純化，并向無血清DMEM-F12培養(yǎng)基中添加人表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，HE染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定，為后續(xù)的篩選試驗提供理想的體外試驗材料。
　　2.以人卵巢癌細(xì)胞HO8910為靶細(xì)胞，分離獲取的人正常卵巢上皮細(xì)胞為吸附細(xì)胞，對噬菌體隨機(jī)環(huán)七肽庫進(jìn)行四輪差減篩選；細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）

4、驗證陽性噬菌體克??；對獲得的陽性克隆進(jìn)行DNA測序及生物信息學(xué)分析,并進(jìn)一步利用免疫熒光實驗,鑒定噬菌體陽性克隆（phage1）與HO8910細(xì)胞的特異性結(jié)合，為針對人卵巢癌不同位點的靶向藥物設(shè)計提供實驗依據(jù)。
　　3.鑒定獲取的噬菌體陽性克隆序列后，合成該特異性短肽序列（命名為peptide1），設(shè)立卵巢癌HO8910-k1組（peptide1組）、HO8910-k15組（control組）及HO8910組（blank組），通過

5、細(xì)胞生長曲線、Transwell體外遷移和重組基底膜侵襲實驗、粘附實驗研究特異性短肽對HO8910細(xì)胞株侵襲和轉(zhuǎn)移能力，探討特異性合成短肽（peptide1）對卵巢癌體外惡性生物學(xué)行為的影響。
　　4.建立特異性短肽結(jié)合HO8910細(xì)胞裸鼠腹腔移植瘤模型，計算抑瘤率，免疫組化計算血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)和原位凋亡TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)（apop

6、totic index，AI），進(jìn)一步探討特異性合成短肽K1（peptide1）對卵巢癌體內(nèi)惡性生物學(xué)行為的影響。
　　結(jié)果:
　　1.卵巢表面上皮培養(yǎng)24小時開始貼壁生長，7~12天后基本達(dá)到融合，細(xì)胞呈多角形或扁平型，透光性及折光性強。細(xì)胞形態(tài)符合正常上皮細(xì)胞特性，所分離的細(xì)胞幾乎完全表達(dá)上皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CK19。細(xì)胞生長良好，可以傳6~8代，細(xì)胞生長曲線呈“S”形，純度達(dá)95%以上。細(xì)胞刷取培養(yǎng)法操作簡單，能夠快速分

7、離獲得大量卵巢表面上皮，所獲得的細(xì)胞經(jīng)紅細(xì)胞裂解法和差速貼壁法處理后純的達(dá)到95%以上，且細(xì)胞生長穩(wěn)定，為組織工程研究提供了充足的種子細(xì)胞。
　　2.經(jīng)過四輪篩選后，噬菌體在靶細(xì)胞HO8910上出現(xiàn)了明顯的富集現(xiàn)象，第4輪篩選后與第1輪相比,富集了244倍；ELISA對20個隨即挑選的克隆進(jìn)行鑒定，12個可與HO8910特異性結(jié)合；DNA測序后得到一段與卵巢癌細(xì)胞特異性結(jié)合的七肽SWQIGGN（命名為K1），免疫熒光檢測顯示表達(dá)S

8、WQIGGN序列的噬菌體克?。╬hage1）能夠與HO8910細(xì)胞結(jié)合，細(xì)胞呈綠色熒光反應(yīng)，并不與人正常卵巢上皮細(xì)胞結(jié)合，提示phage1能與HO8910細(xì)胞特異結(jié)合。
　　3.合成并純化后的的K1，細(xì)胞生長曲線顯示K1組HO8910細(xì)胞自第三天開始生長速度明顯慢于其它兩組，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。粘附實驗和細(xì)胞體外遷移侵襲實驗表明合成的特異性短肽K1（SWQIGGN）能明顯抑制HO8910PM的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，與對照組

9、相比P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明特異性短肽K1（SWQIGGN）能夠在體外抑制卵巢癌HO8910細(xì)胞的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移。
　　4.腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移體內(nèi)實驗表明特異性短肽K1（SWQIGGN）組裸鼠生長速度明顯受到抑制、腫瘤體積、質(zhì)量及播散數(shù)目均減少，與對照組及空白組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.5），而對照組與空白組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.5）。表明SWQIGGN肽能夠抑制HO8910細(xì)胞的增長，并能夠在體內(nèi)抑制

10、卵巢癌HO8910細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。
　　結(jié)論:
　　1.運用細(xì)胞刷取法成功培養(yǎng)出人卵巢表面上皮，該方法不僅簡便，而且高效實用，為卵巢癌的基礎(chǔ)和臨床研究提供了理想的試驗材料。
　　2.采用BRASIL噬菌體展示技術(shù)和全細(xì)胞差減篩選策略，篩選出卵巢癌表面分子特異性的結(jié)合短肽SWQIGGN，為卵巢癌的靶向治療提供了可能的作用靶向結(jié)合位點。
　　3.SWQIGGN短肽能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的體內(nèi)外生長、侵襲及轉(zhuǎn)移能力。