Id1對(duì)卵巢癌內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一,其發(fā)病率居?jì)D科腫瘤第三位。然而卵巢癌的死亡率高居?jì)D科腫瘤首位,5年生存率仍然徘徊在30％左右。近年來(lái),基因治療、靶向治療作為腫瘤治療的新生代模式日益受到重視。通過(guò)基因芯片和蛋白質(zhì)組技術(shù)在卵巢癌研究中的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)了很多潛在價(jià)值的標(biāo)志物。但目前還沒有找到特有效的特異性標(biāo)志物,對(duì)于生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的分了機(jī)理也缺乏一定的了解。轉(zhuǎn)移是影響卵巢癌患者治療效果和死亡的主要因?yàn)?探討與卵巢癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移相

2、關(guān)的因素,尋找預(yù)防和治療的有效途徑,是當(dāng)代腫瘤學(xué)研究的一項(xiàng)迫切任務(wù)。
　　 腫瘤血管化是腫瘤從體積小、局限性的非浸潤(rùn)性腫瘤發(fā)展成為體積大、具有浸潤(rùn)性和轉(zhuǎn)移能力的腫瘤的關(guān)鍵步驟?？寡苌墒遣煌诔Ｒ?guī)抗腫瘤治療的新策略,并以成為腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。最近研究闡明了微量的骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)參與腫瘤的血管發(fā)生,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng),是腫瘤轉(zhuǎn)移的開關(guān)。
　　 分化抑制

3、因子1(inhibitors of differentiation 1,Id1)又稱DNA結(jié)合抑制因子(inhibitors of DNA binding),屬于螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix,HL H)轉(zhuǎn)錄因子家族,它顯性負(fù)調(diào)控堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子活性,從而抑制細(xì)胞分化,促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究表明,Id1在人體腫瘤標(biāo)本及體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中均呈過(guò)表達(dá)。Schindl等檢測(cè)了卵巢癌中Id1的表達(dá),結(jié)果表明

4、,卵巢痛的惡性程度與Id1的表達(dá)水平呈正相關(guān)。Lyden等的研究首次表明,Id1和Id3在與血管生成相關(guān)的VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用,提示Id1與腫瘤的血管新生有關(guān)。Id1敲除的小鼠由于骨髓相關(guān)的血管生成缺陷,表現(xiàn)破壞腫瘤生長(zhǎng)。而EPCs來(lái)源于骨髓,并參與新血管形成,所以EPCs與Id1關(guān)系很密切。最近研究報(bào)道腫瘤誘導(dǎo)Id1表達(dá)于骨髓來(lái)源的EPCs,而在骨髓中的其它細(xì)胞不表達(dá),因此Id1對(duì)于EPCs功能是很重要的。骨髓中Id1缺失

5、導(dǎo)致外周血EPCs數(shù)量減少,以至于阻止腫瘤血管生成和延緩腫瘤生長(zhǎng),外周血EPCs的數(shù)量與EPCs的生物學(xué)功能及動(dòng)員機(jī)制有關(guān)。所以Id1可能介導(dǎo)腫瘤EPCs的動(dòng)員和歸巢,但具體機(jī)制還不十分清楚。
　　 既往研究表明多種因素如細(xì)胞因子(VEGF/EPO/SDF-1)、他汀類藥物及基因轉(zhuǎn)染(VEGF/SDF-1)等可以明顯改善EPCs生物學(xué)功能,動(dòng)員其至外周血,增加局部區(qū)域EPCs數(shù)量,改善缺血組織血管新生、修復(fù)損傷血管內(nèi)皮。EPCs

6、體內(nèi)外調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,涉及多種信號(hào)通路。
　　 本研究重點(diǎn)探討Id1基因?qū)β殉餐碋PCs增殖、黏附、遷移及血管生成的影響和作用機(jī)制,闡明Id1在卵巢癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移中的主要生物學(xué)功能,為卵巢痛生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的病程監(jiān)測(cè)和治療奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 1.卵巢癌患者EPCs水平的檢測(cè)及臨床意義
　　 選擇經(jīng)臨床及病理檢查確診的卵巢癌患者42例,健康對(duì)照者25例,用流式分析儀測(cè)定其外周血EPCs水平；并通過(guò)熒光定量P

7、CR對(duì)EPCs標(biāo)記物CD34和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)基因進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)用EIASA檢測(cè)了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶.9(MMP-9)的蛋白水平。
　　 2.卵巢癌患者EPCs中Id1的表達(dá)及其EPCs的生物學(xué)特性
　　 密度梯度離心法分離25例卵巢癌患者和20例健康對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞,培養(yǎng)7天后,收集貼壁細(xì)胞,采用熒光顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和Dil-acLDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為

8、正在分化的EPCs；同時(shí)檢測(cè)了內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物VEGFR2、CD31和vWF的表達(dá)；通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型；利用熒光定量PCR和Western blot方法進(jìn)行卵巢癌組和健康對(duì)照組的EPCs中Id1表達(dá)水平檢測(cè)；利用MTT比色法檢測(cè)EPCs增殖、體外黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPCs黏附基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞的能力、Transwell小室法檢測(cè)遷移以及Matrigel法檢測(cè)血管生成的能力。
　　 3.慢病毒攜帶shRNA對(duì)卵巢癌EPCs中Id1表達(dá)

9、的抑制作用以及對(duì)EPCs生物學(xué)特性的影響
　　 利用在線軟件設(shè)計(jì)3個(gè)位點(diǎn)的Id1干擾序列。采用慢病毒載體系統(tǒng)卣pGC-LV載體、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體三質(zhì)粒組成,構(gòu)建目標(biāo)基因Id1的慢病毒shRNA表達(dá)載體,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證,在293T細(xì)胞中包裝病毒粒子,病毒包括4種,目標(biāo)基因Id1的Id1-1、Id1-2和Id1-3以及陰性對(duì)照Id1-NC。分別對(duì)這4個(gè)病毒粒子進(jìn)行滴度測(cè)定。我們采用體外培養(yǎng)的人卵巢癌

10、細(xì)胞株SKOV-3進(jìn)行有效靶點(diǎn)的篩選。然后對(duì)卵巢癌EPCs進(jìn)行感染,利用熒光定量PCR、Western blot方法進(jìn)行各感染組的Id1表達(dá)水平檢測(cè)。在有效沉默EPCs中Id1的基礎(chǔ)上,MTT比色法檢測(cè)慢病毒載體轉(zhuǎn)染后,Id1對(duì)EPCs體外增殖的影響、黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Id1對(duì)EPCs黏附基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞能力的影響、以及Transwell小室法檢測(cè)Id1對(duì)EPCs遷移能力的影響及利用Matrigel法檢測(cè)Id1對(duì)EPCs血管生成功能的影響。

11、r>　　 4.Id1對(duì)卵巢癌EPCs生物學(xué)特性影響的機(jī)制研究
　　 應(yīng)用熒光定量PCR及western blot明確卵巢癌EPCs是否表達(dá)整合素α4；給予Id1的慢病毒shRNA表達(dá)載體后檢測(cè)整合素α4的變化。用Western blot檢測(cè)卵巢癌是否對(duì)EPCs中Akt蛋白磷酸化有影響,給予P13K信號(hào)通路阻斷劑LN294002,用Western blot檢測(cè)EPCs中Akt蛋白磷酸化、Id1以及整合素α4的水平變化；同時(shí)觀察L

12、Y294002對(duì)EPCs增殖、黏附和遷移以及血管生成能力的影響。
　　 結(jié)論
　　 1.卵巢癌患者外周血的EPCs水平可以作為監(jiān)測(cè)病程,血管新生或反映療效的一個(gè)有效的實(shí)驗(yàn)診斷指標(biāo)。
　　 2.研究發(fā)現(xiàn)在卵巢痛患者的外周血EPCs中Id1水平呈現(xiàn)高表達(dá)。并且卵巢痛患者EPCs的增殖能力、細(xì)胞粘附能力,遷移和血管生成能力都高于健康正常人。這一結(jié)果表明Id1基因的高表達(dá)及伴隨出現(xiàn)的EPCs增強(qiáng)的生物學(xué)功能在卵巢痛的發(fā)生

13、發(fā)展過(guò)程中,尤其是腫瘤的血管新生以及加速生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移方面起著重要的作用。
　　 3.成功地構(gòu)建了人Id1基因RNAi慢病毒載體,克隆出Id1-1、Id1-2、Id1-3和Id1-NC四個(gè)干擾載體,進(jìn)行慢病毒的包裝和滴度測(cè)定,熒光定量PCR、Westernblot顯示其中Id1-3位點(diǎn)Id1干擾效果最好。用Id1-3和Id1-NC位點(diǎn)的慢病毒感染EPCs降低了體外EPCs增殖能力、細(xì)胞粘附能力,遷移和血管生成能力,提示Id1表達(dá)沉默