載去甲萬古霉素鋼板的研制及防治兔脛骨感染的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及研究目的： 隨著材料科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展，骨科手術(shù)率和術(shù)中各種內(nèi)、外固定器械的使用率日益上升。但是相伴而生的骨和軟組織感染作為骨科手術(shù)最常見和復(fù)雜的并發(fā)癥，也早己成為骨科醫(yī)生所面臨的極富挑戰(zhàn)性的難題之一。據(jù)AO組織2006年報(bào)道：每年在美國約有200萬例院內(nèi)感染病例，其中約50％與內(nèi)植物有關(guān)。在使用內(nèi)固定的人群中約5％發(fā)生了感染。同時(shí)，內(nèi)固定術(shù)后感染可能還會導(dǎo)致包括由于全身應(yīng)用抗生素、多次清創(chuàng)翻修手術(shù)、住院時(shí)間延長、截

2、肢甚至死亡等對患者不利的嚴(yán)重后果。因此，內(nèi)固定術(shù)后感染早已成為研究焦點(diǎn)之一。 目前觀點(diǎn)認(rèn)為，與內(nèi)固定術(shù)后感染主要表現(xiàn)為軟組織感染和骨髓炎兩種形式[4)，是使用內(nèi)固定所導(dǎo)致的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。尤其在開放性骨折中，各種固定器材包括鋼板螺絲釘、外固定支架、髓內(nèi)針等均可能和感染有關(guān)(3,5，6,7)。資料顯示：通常閉合性骨折的感染率約1.5％，而開放性骨折的感染率則高達(dá)3-40％(8，9)。創(chuàng)傷所致的開放性骨折呈逐年上升的趨勢。在開放性骨

3、折中約60％以上的在損傷時(shí)受到了細(xì)菌的污染(5，10，11)。術(shù)后為預(yù)防感染，醫(yī)生都會大劑量使用廣譜抗生素。但是，盡管采取了上述積極的措施，不幸的是仍有一部分患者發(fā)生了感染(3)。對這部分病人的后期處理是骨科領(lǐng)域非常棘手的一個(gè)問題。 骨折后通常會使用內(nèi)固定或者外固定材料來固定骨折部位。而內(nèi)固定具有固定效果確定，便于早期進(jìn)行功能鍛煉，便于護(hù)理的優(yōu)點(diǎn)，在患者病情允許情況下，是骨科醫(yī)生的首選。鋼板往往被推薦在閉合性骨折和Gustilo

4、Ⅰ型開放性骨折中使用。一般認(rèn)為，傷口是否發(fā)生感染主要取決于傷口的性質(zhì)、細(xì)菌的數(shù)量與毒力和宿主抵抗能力，以及傷口內(nèi)異物的存留。最常見的導(dǎo)致“固定物與感染”的細(xì)菌為金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌均可以產(chǎn)生生物膜。生物膜的形成分兩部進(jìn)行(39)，首先是細(xì)菌黏附于固定物的表面，然后細(xì)菌之間相互黏附形成多層狀的細(xì)菌以進(jìn)入細(xì)菌靜止或休眠期，從而抵抗臨床抗生素治療和免疫系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞清除細(xì)菌。金黃色葡萄球菌是導(dǎo)致手術(shù)或創(chuàng)傷

5、后的主要致病菌(30％)，是內(nèi)植物相關(guān)的骨與關(guān)節(jié)、軟組織感染的首要細(xì)菌。它一旦進(jìn)入淋巴管或血液中，將導(dǎo)致膿毒癥。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistants.aureusMRSAs)具有耐β-內(nèi)酰胺類抗生素如青霉素、三代頭孢、鏈霉素、四環(huán)素及磺胺類藥物的特點(diǎn)，并且對氨基糖肽類抗生素和萬古霉素的敏感性也在降低。目前已有對萬古霉素和替考拉寧耐藥的報(bào)道。當(dāng)金黃色葡萄球菌黏附在固定物表面時(shí)，人體細(xì)胞并不能將其清除掉。骨

6、感染的結(jié)果就是急性或慢性骨髓炎。其病理類型與細(xì)菌類型無關(guān)，但是金葡菌感染更易于產(chǎn)生慢性侵襲性骨髓炎。 按照感染發(fā)生的時(shí)間，主要將其分為三類：早期感染(小于2周)，主要在創(chuàng)傷或固定手術(shù)期間獲得感染，是高致病性微生物感染(金葡菌、革蘭氏陰性桿菌)所致。延遲感染(2-10周)和晚期感染(超過10周)，主要在創(chuàng)傷或固定手術(shù)期間獲得感染，低致病性微生物感染(凝固酶陰性葡萄球菌)，偶爾由遠(yuǎn)隔部位的血源性播種所致。早期感染的臨床癥狀出現(xiàn)得較早

7、并持續(xù)出現(xiàn)局部疼痛、大血腫、發(fā)熱，常見致病菌為高毒力型，當(dāng)傷口愈合受到影響的時(shí)候，必須積極地尋找傷口的壞死邊緣和術(shù)后的血腫及感染灶(96,97)。延遲和晚期感染的臨床表現(xiàn)、治療及預(yù)后相似。一般表現(xiàn)為持續(xù)或者加重的疼痛、假關(guān)節(jié)形成、固定物松動、有時(shí)出現(xiàn)的竇道是延遲感染的標(biāo)志。但也有臨床癥狀和體征缺乏的病例。其主要致病菌為低毒力型。其可能發(fā)生的原因是早期抗感染的力度不足以使微生物徹底根除，與假體關(guān)節(jié)感染相反，固定物所導(dǎo)致的晚期感染發(fā)生頻率較

8、低(98)。 內(nèi)固定術(shù)后感染的治療包括手術(shù)治療和抗生素治療，抗生素的使用往往在配合手術(shù)翻修或取出固定物和徹底清創(chuàng)的基礎(chǔ)上使用。針對抗生素的使用方法可以歸納為全身使用和局部使用兩類。局部抗生素的使用是治療固定物感染的重要措施之一，目前多采用緩釋載體載抗生素以期在局部產(chǎn)生較長時(shí)間的局部高濃度抗生素。其基本理念均為：抗生素在特定的部位逐步地釋放抗生素，獲得較全身性使用抗生素更高的濃度。 在目前內(nèi)固定術(shù)后感染發(fā)生率高、抗生素耐藥

9、菌株日益增加和系統(tǒng)性全身應(yīng)用抗生素局限性逐漸被認(rèn)識的背景下，局部預(yù)防性或治療性應(yīng)用抗生素已成為在固定物相關(guān)感染的治療中具有前景的主要措施之一。尤其是把固定物與抗生素組合或者合成在一起的途徑，對醫(yī)生來說極具吸引力。這種設(shè)想把固定物本身變成了“抗生素釋放系統(tǒng)”，其好處是顯而易見的：在同往常一樣植入固定物的同時(shí)獲得了額外的局部釋放抗生素的益處，使局部聚集了高濃度的抗生素而很少有全身性的副作用，特別是在如髓內(nèi)針固定術(shù)等閉合性復(fù)位的手術(shù)中，更有利

10、于患者的治療。同時(shí)，通過生物降解材料可以把抗生素物質(zhì)限定在一定的時(shí)間段內(nèi)釋放以產(chǎn)生合理的藥效學(xué)，最大程度的減少了對耐藥菌株篩選的風(fēng)險(xiǎn)。因此被看作是骨科器械發(fā)展的“未來”。 抗生素涂層的理論首先由Darouice(169)于1998年提出并實(shí)施。目前應(yīng)用較多的途徑是生物降解材料如聚D,L-乳酸(polyD,L-LactidePDLLA)負(fù)載抗生素以達(dá)到預(yù)防或治療感染的目的。局部抗生素釋放系統(tǒng)應(yīng)該達(dá)到以下基本要求：緩釋技術(shù)必須保證快

11、速釋放超過MIC濃度水平的抗生素；藥物釋放必須在一定的時(shí)間內(nèi)，避免產(chǎn)生耐藥性菌株；殺菌性抗生素應(yīng)該產(chǎn)生殺菌效應(yīng)，而不是僅僅抑菌；藥物緩釋系統(tǒng)應(yīng)該自行降解。PDLLA涂層不僅具備上述條件，而且有利于阻止細(xì)菌黏附在固定物表面。 MRSA對絕大多數(shù)抗生素交叉耐藥，但是仍然對萬古霉素或去甲萬古霉素100％敏感。在體外藥敏實(shí)驗(yàn)中，去甲萬古霉素對MRSA非常有效，而且與其它種類的抗菌藥物無交叉耐藥。另外用MRSA在試管內(nèi)進(jìn)行傳代培養(yǎng)試驗(yàn)，其

12、對萬古霉素的誘導(dǎo)耐藥性也很低。去甲萬古霉素能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，發(fā)揮殺菌作用。另外還可以通過改變細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，阻礙細(xì)菌RNA的合成的機(jī)制殺滅細(xì)菌。目前，去甲萬古霉素對MRSA的MIC90為0.5-3.1mg/L。 因此，在內(nèi)固定表面涂層技術(shù)漸趨成熟的啟示下，我們采用治療金葡菌感染的特效藥物去甲萬古霉素，研制出“載去甲萬古霉素聚乳酸緩釋鋼板”。自內(nèi)而外的早期釋放去甲萬古霉素，直接殺滅金葡菌，破壞或阻礙固定物表面生物膜的形

13、成，通過檢測該鋼板釋放去甲萬古霉素的釋放動力學(xué)及其對金黃色葡萄球菌體外抑菌作用和新西蘭大白兔脛骨中段橫斷模型，探討其在創(chuàng)傷性骨髓炎的預(yù)防和治療的應(yīng)用前景。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.采用乙酸乙酯、丙酮、水的三元溶劑組合，運(yùn)用溶膠-凝膠法制作載去甲萬古霉素鋼板。 2.將兩種鋼板分別浸于1ml和10ml的浸提液中，應(yīng)用凝膠滲透色譜和高效液相色譜儀分別檢測PDLLA的降解和去甲萬古霉素的局部釋放濃度，了解該鋼板釋放去甲萬古霉素的

14、動力學(xué)過程。 3.將載萬古霉素鋼板和普通鋼板分別與不同濃度的金葡菌混懸液進(jìn)行普通培養(yǎng)后計(jì)數(shù)金葡菌菌落數(shù)。掃描電鏡檢查鋼板金葡菌在兩種鋼板表面的黏附情況。 4.制備脛骨中段單側(cè)皮質(zhì)橫斷骨折并金葡菌污染模型，分別置入載去甲萬古霉素緩釋鋼板和普通不銹鋼鋼板，比較兩種鋼板對兔脛骨金葡菌感染模型的預(yù)防作用。 5.制備兔脛骨中段單側(cè)皮質(zhì)橫斷骨折并感染的模型。分別置入載去甲萬古霉素緩釋鋼板和普通不銹鋼鋼板，比較兩種鋼板對兔脛骨

15、金葡菌感染模型的治療作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.采用乙酸乙酯、丙酮、水的三元溶劑組合，運(yùn)用溶膠-凝膠法制作載去甲萬古霉素聚乳酸緩釋鋼板。涂層中的聚D,L-乳酸(polyD,L-Lactide，PDLLA)降解失重率在第1、3、7、14、28天分別為0.4％、0.9％、1.75％、2.65％、4.76％。涂層中去甲萬古霉素的局部釋放濃度在35天內(nèi)均高于去甲萬古霉素對金葡菌的最低抑菌濃度。 2.載去甲萬古霉素緩釋鋼板可以

16、有效降低兔脛骨金黃色葡萄球菌污染模型的感染率。提示涂層中釋放的去甲萬古霉素在可以有效殺滅傷口污染的金葡菌。 3.載去甲萬古霉素緩釋鋼板可以有效降低脛骨金黃色葡萄球菌污染模型大白兔術(shù)后第3、7、14天靜脈血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和CRP含量。但是對大白兔的肛溫和體重沒有影響。 4.載去甲萬古霉素鋼板周圍組織中去甲萬古霉素的濃度在植入后28天仍然達(dá)到最低抑菌濃度。同時(shí)血漿中的濃度極低?？梢杂行П苊馊硎褂萌ゼ兹f古霉素的副作用。

17、5.載去甲萬古霉素緩釋鋼板對脛骨感染性骨折兔的感染控制率高于普通鋼板。 結(jié)論： 1.采用溶膠-凝膠法可以成功制作載去甲萬古霉素聚乳酸鋼板。在檢測的35天內(nèi)，該鋼板在體外釋放去甲萬古霉素的釋放動力學(xué)穩(wěn)定，同時(shí)鹽酸去甲萬古霉素的載體PDLLA也能穩(wěn)定、勻速地降解。 2.釋放的鹽酸去甲萬古霉素可以有效抑制金葡菌菌落的生長以及減少其金葡菌在鋼板表面的黏附，說明載去甲萬古霉素緩釋鋼板在體外可以有效抑菌。為該鋼板在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中