研究雙氫青蒿素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡的影響及機(jī)制探討.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模呵噍锼?，是一種極有效的抗瘧疾中草藥。其高效、低毒的抗瘧疾作用，除被廣泛應(yīng)用于治療瘧疾外，許多研究已經(jīng)證明，青蒿素還有顯著的抗腫瘤效果。本研究以青蒿素的衍生物:雙氫青蒿素(DHA)為研究對(duì)象，研究其對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡的影響，并進(jìn)行分子機(jī)制探究。
　　 實(shí)驗(yàn)方法及步驟：體外培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞株（MG63，U2OS，143B和Saos2），應(yīng)用不同濃度的DHA分別對(duì)其干預(yù)24h和48h，篩選出對(duì)DHA最敏感細(xì)胞株和

2、DHA的有效濃度范圍。采用多種檢測(cè)技術(shù)對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲等進(jìn)行檢測(cè)，觀察DHA對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞的影響，以及分子機(jī)制探討。實(shí)驗(yàn)分組:空白對(duì)照（Control組），溶劑對(duì)照(0.1％ DMSO)，實(shí)驗(yàn)組（三個(gè)不同濃度的雙氫青蒿素）。主要實(shí)驗(yàn)步驟如下:
　　 1.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):結(jié)晶紫染色法和MTT（噻唑藍(lán)）比色，分別對(duì)DHA干預(yù)前后細(xì)胞增殖活性進(jìn)行定性、定量檢測(cè);克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DHA對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響，結(jié)

3、晶紫染色法指示克隆形成個(gè)數(shù)，并計(jì)算克隆形成率。篩選敏感細(xì)胞株和敏感藥物濃度范圍。再對(duì)選定的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理后，用Western blotting法，檢測(cè)與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物:PCNA、Cyclin D1、c-Myc的表達(dá)差異。
　　 2.體外培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞143B，用Hoechst33258凋亡染色法和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)，觀察DHA作用前后對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞周期、凋亡發(fā)生及細(xì)胞形態(tài)的影響。用Western b

4、lotting方法檢測(cè)腫瘤凋亡相關(guān)蛋白標(biāo)志物:Bad、Bcl-2、cleaved-caspase-3等的表達(dá)差異。
　　 3.采用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell小室穿梭實(shí)驗(yàn)和Transwell人工基質(zhì)膠穿梭模擬實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)DHA處理前后人骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力變化。用Western blotting法檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)蛋白質(zhì)標(biāo)志物:VEGF和MMP-9的表達(dá)差異。
　　 4.構(gòu)建β-Catenin基因的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒

5、(β-Catenin-Luc，p-Top)，檢測(cè)DHA作用前后細(xì)胞內(nèi)基因β-Catenin活性變化，用Westernblot法檢測(cè)Wnt/β-Catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子:GSK-3-β，p-GSK-3-β，β-catenin，Axin，Dvl和E-Cadherin，以及靶基因:COX-2、Cyclin D1和c-Myc等的表達(dá)差異，探討Wnt/β-Catenin信號(hào)通路在DHA作用于人骨肉瘤細(xì)胞后，對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響。<

6、br>　　 5.構(gòu)建人骨肉瘤小鼠模型（裸鼠脛骨近端，骨膜下異位成瘤），采用口服給藥，觀察DHA對(duì)骨肉瘤的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.四株人骨肉瘤細(xì)胞（MG63，U2OS，143B和Saos2）都表現(xiàn)為對(duì)DHA敏感，DHA適宜濃度范圍為10～40μM。DHA處理后，細(xì)胞增殖活性顯著下降，克隆形成能力受抑制，且有隨著濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而藥物干預(yù)效應(yīng)增強(qiáng)的變化趨勢(shì)。其中，143B細(xì)胞表現(xiàn)更敏感，與MG63、U2

7、OS和Saos2相比，其生物學(xué)特性理工明顯（如惡性程度最高，更易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移）。因此，選擇143B細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)處理組選擇高、中、低濃度的DHA依次為15μM、25μM和35μM）。腫瘤增殖相關(guān)蛋白質(zhì)標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果表明，DHA有效地抑制其蛋白質(zhì)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照級(jí)別比較，有顯著性差異。
　　 2.米用Hoechst33258凋亡檢測(cè)技術(shù)和細(xì)胞流式(FCM)分析方法，分別對(duì)DHA處理前后，細(xì)胞凋亡進(jìn)行分析。FCM結(jié)果顯

8、示，與對(duì)照組比較，DHA處理后凋亡細(xì)胞百分比增高可達(dá)67％; Hoechst33258熒光染色結(jié)果顯示，染色質(zhì)凝集，胞核碎裂呈現(xiàn)典型的凋亡體，胞體縮小。與對(duì)照組比較，DHA處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)腫瘤凋亡相關(guān)蛋白標(biāo)志物表達(dá)增加達(dá)56％。
　　 3.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)及人工模擬組織基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)DHA處理后，人骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力明顯減弱，腫瘤細(xì)胞自身分泌的具有破壞組織基底膜及膠原的基質(zhì)金發(fā)蛋白酶(MMP)的合成受到明顯抑制;具有促進(jìn)骨

9、肉瘤轉(zhuǎn)移、促進(jìn)異位血管生成的血管生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)顯著降低。由此可見(jiàn)，DHA能有效抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和血管異位生成。
　　 4.Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，是諸多腫瘤相關(guān)信號(hào)通路中研究最多、較透徹的通路之一。本研究通過(guò)比較DHA干預(yù)前后Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子的差異表達(dá)，結(jié)果表明，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)腫瘤具有促進(jìn)調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)

10、因子，如β-Catenin、p-GSK-3β、Dvl和核內(nèi)靶基因如CyclinD1、c-Myc、COX-2，都有不同程度的表達(dá)抑制;而對(duì)腫瘤進(jìn)展負(fù)向調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)因子，如E-cadherin和Axin，都不同程度地表達(dá)增加。由此推測(cè)，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在DHA干擾人骨肉瘤發(fā)展中起到不可忽略的調(diào)節(jié)作用。
　　 5.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果DHA表現(xiàn)出顯著的干擾人骨肉瘤生長(zhǎng)的能力。因此，本課題通過(guò)構(gòu)建人骨肉瘤小鼠移植瘤模型，口

11、服給藥，觀察其對(duì)實(shí)體瘤的影響。組織病理學(xué)分析結(jié)果表明，人骨肉瘤小鼠移植瘤模型構(gòu)建成功，腫瘤組織是典型的骨內(nèi)瘤形態(tài)表現(xiàn)。肺組織切片病理分析顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠未發(fā)生可見(jiàn)的肺轉(zhuǎn)移，而對(duì)照組小鼠模型發(fā)生了可見(jiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移灶，經(jīng)確認(rèn)是骨肉瘤。腫瘤體積變化曲線顯示，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積增長(zhǎng)速度較對(duì)照組明顯受到抑制，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：雙氫青蒿素，除作為一種有效的抗瘧疾藥外，還具有顯著的抗腫瘤效應(yīng)，如對(duì)宮頸癌、直結(jié)腸癌等有明顯的抑制作用。本課題研究結(jié)果表明