脂聯(lián)素通過mTOR信號通路對骨肉瘤細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分脂聯(lián)素對骨肉瘤細(xì)胞增殖及凋亡的作用影響
　　目的:探討脂聯(lián)素對骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡等功能的具體作用影響及其機(jī)制。
　　方法:免疫印跡(WB)檢測三種不同人骨肉瘤細(xì)胞株(MG-63、Saos-2、U2OS)及正常人成骨細(xì)胞株hFOB1.19中脂聯(lián)素受體(AdipoR1、AdipoR2)表達(dá)情況;用不同濃度脂聯(lián)素干預(yù)處理三種不同骨肉瘤細(xì)胞株，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖并篩選出對脂聯(lián)素敏感的細(xì)胞株及適宜的脂聯(lián)素干預(yù)濃度。根據(jù)

2、上述篩選結(jié)果，用脂聯(lián)素處理骨肉瘤敏感細(xì)胞株后，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化，TUNEL和DAPI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況，WB法檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　①WB顯示兩種脂聯(lián)素受體(AdipoR1、AdipoR2)在三種人骨肉瘤細(xì)胞株(MG-63、Saos-2、U2OS)及正常人成骨細(xì)胞株hFOB1.19中均有表達(dá)。其中MG-63、Saos-2、U2OS中Adi

3、poR1的表達(dá)均顯著高于hFOB1.19中表達(dá)(p＜0.05); Saos-2細(xì)胞中AdipoR1表達(dá)量最高，其與MG-63及U2OS細(xì)胞相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05); Saos-2細(xì)胞中AdipoR2表達(dá)水平亦最高，與hFOB1.19相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05); MG-63、U2OS及hFOB1.19細(xì)胞中AdipoR2表達(dá)量無顯著差異(p＞0.05)。
　?、贑CK-8法檢測不同濃度脂聯(lián)素以不同時(shí)間處

4、理三種人骨肉瘤細(xì)胞株(MG-63、Saos-2、U2OS)后OD值變化，并計(jì)算相應(yīng)濃度及時(shí)間對骨肉瘤細(xì)胞的抑制率。結(jié)果顯示脂聯(lián)素對三種骨肉瘤細(xì)胞均具有增殖抑制作用，且該效應(yīng)具有劑量依賴性。當(dāng)脂聯(lián)素濃度達(dá)20ug/ml后，再增加其劑量，其對細(xì)胞增殖抑制率的增幅下降，表明其作用劑量達(dá)到相對平臺期。相同濃度脂聯(lián)素以相同時(shí)間處理不同骨肉瘤細(xì)胞株，其對MG-63細(xì)胞增殖抑制率最高，表明MG-63細(xì)胞對脂聯(lián)素刺激敏感性最高。
　　③流式細(xì)胞術(shù)

5、檢測脂聯(lián)素干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞后細(xì)胞周期變化，結(jié)果顯示與空白對照組相比，10ug/ml脂聯(lián)素處理組中細(xì)胞G0/G1期比例上升，但差異并不顯著(p＞0.05)，但其S期比例有顯著下降(p＜0.01)。與空白對照組相比，20ug/ml脂聯(lián)素處理組細(xì)胞G0/G1期比例顯著上升(p＜0.05)，G2期與S期比例則均顯著下降(p＜0.01;p＜0.01)。與10ug/ml脂聯(lián)素處理組相比，20ug/ml脂聯(lián)素處理組細(xì)胞G0/G1期比例顯著上升(p＜0.

6、01)，其G2期與S期比例均顯著下降(p＜0.01; p＜0.01)。
　?、躎UNEL與DAPI共染檢測脂聯(lián)素處理骨肉瘤細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率變化，結(jié)果顯示與空白對照組(2.57±0.44％)相比，10ug/ml脂聯(lián)素處理組(6.52±0.878％)與20ug/ml脂聯(lián)素處理組(8.24±0.11％)細(xì)胞凋亡率均明顯增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　⑤WB檢測脂聯(lián)素處理骨肉瘤細(xì)胞后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1

7、與凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3變化，結(jié)果顯示，經(jīng)脂聯(lián)素處理后，與空白對照組(1.276±0.081)相比，10ug/ml脂聯(lián)素處理組(0.995±0.113)與20ug/ml脂聯(lián)素處理組(0.904±0.095)細(xì)胞中Cyclin D1表達(dá)均顯著降低(p＜0.01; p＜0.01)。20ug/ml脂聯(lián)素組中Cyclin D1表達(dá)比10ug/ml脂聯(lián)素處理組表達(dá)更低，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。此外，與空白對照組(0.794

8、±0.033)相比，10ug/ml脂聯(lián)素處理組(1.027±0.083)與20ug/ml脂聯(lián)素處理組(1.069±0.142)中Caspase-3表達(dá)均顯著升高(p＜0.05; p＜0.01)。20ug/ml脂聯(lián)素處理組中Caspase-3表達(dá)比10ug/ml脂聯(lián)素處理組表達(dá)更高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　結(jié)論:兩種脂聯(lián)素受體(AdipoR1及AdipoR2)在人骨肉瘤細(xì)胞株及正常人成骨細(xì)胞中均有表達(dá)，不同骨肉

9、瘤細(xì)胞株中脂聯(lián)素受體表達(dá)量亦不同;脂聯(lián)素對骨肉瘤細(xì)胞具有增殖抑制和促進(jìn)凋亡等作用，且該作用具有劑量依賴性，其對骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響可能與調(diào)控Cyclin D1及Caspase-3表達(dá)相關(guān)。
　　第二部分脂聯(lián)素通過mTOR信號通路影響骨肉瘤細(xì)胞增殖凋亡的作用機(jī)制探討
　　目的:通過mTOR信號通路探討脂聯(lián)素對骨肉瘤細(xì)胞增殖凋亡的具體作用機(jī)制。
　　方法:用不同濃度脂聯(lián)素，以不同干預(yù)時(shí)間處理骨肉瘤敏感細(xì)胞株MG-63

10、，蛋白印跡(WB)檢測mTOR下游信號通路靶蛋白p70S6K1、p-p70 S6K1(Thr389)、4EBP1、p-4EBP1(Thr37/46)，以及mTOR上游信號通路蛋白Akt、p-Akt(Ser473)等蛋白表達(dá)變化;通過慢病毒轉(zhuǎn)染mTOR上游激活子—Rheb1過表達(dá)骨肉瘤MG-63細(xì)胞株中mTOR，或以PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002干預(yù)骨肉瘤MG-63細(xì)胞株中mTOR信號通路，再行脂聯(lián)素干預(yù)，WB法檢測MG-6

11、3細(xì)胞中細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3等表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果:脂聯(lián)素能呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞中mTOR下游信號通路，表現(xiàn)為mTOR下游信號蛋白p70 S6K1(Thr389)、4EBP1（Thr47/46）磷酸化水平呈劑量依賴性或時(shí)間依賴性梯度下降。脂聯(lián)素亦能呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性下調(diào)mTOR上游信號通路，表現(xiàn)為Akt(Ser473)磷酸化水平呈劑量依賴性或時(shí)間依

12、賴性梯度下降。慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)Rheb1激活骨肉瘤MG-63細(xì)胞mTOR后，再行脂聯(lián)素刺激，其細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1下降幅度減小，且凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3上升幅度減小，表明活化mTOR通路后脂聯(lián)素對骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用減弱;脂聯(lián)素與PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002對骨肉瘤MG-63細(xì)胞株的增殖抑制或凋亡誘導(dǎo)作用具有協(xié)同效應(yīng)。
　　結(jié)論:脂聯(lián)素可能通過抑制Akt磷酸化，阻斷mTOR信號通路