雙氫青蒿素聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)人肺腺癌H1299細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：肺癌的發(fā)病率及相關(guān)死亡率在目前全球癌癥中所占比例最高。其中80％的肺癌病人為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。目前臨床一線使用的含鉑化療方案有效率僅有30%。因此，大家迫切的需要找到一種新的化療藥物來(lái)提高肺癌病人的治療效率。近年的許多研究中，青蒿素及其衍生物在一些對(duì)其他藥物敏感及耐藥的腫瘤細(xì)胞株中均展現(xiàn)出了強(qiáng)大的抗癌活性。雙氫青蒿素（DHA）—一種已知的青蒿素的衍生物，這些年來(lái)，它的抗癌活性在世界范圍內(nèi)被各國(guó)學(xué)者廣泛研究。而雙氫青蒿素也

2、展現(xiàn)出了對(duì)腫瘤細(xì)胞株如神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞的抗癌作用。大量的研究表明許多腫瘤細(xì)胞p53基因的缺失或未表達(dá)均與化療的耐藥有關(guān)。但迄今為止，尚未查到關(guān)于雙氫青蒿素聯(lián)合順鉑（Cis）作用于p53缺失型人肺腺癌H1299細(xì)胞系的相關(guān)研究。而這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)初衷就是研究雙氫青蒿素聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)H1299細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用及其潛在的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)人類肺腺癌H129

3、9細(xì)胞并將細(xì)胞分為四組：雙氫青蒿素（DHA）組、順鉑（Cis）組、聯(lián)合用藥組及對(duì)照組，通過(guò)四甲基偶氮唑鹽/噻唑藍(lán)（MTT）實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)不同處理組間H1299細(xì)胞抑制率的變化情況。
　　2.采用p53基因正常表達(dá)的A549細(xì)胞作為對(duì)照，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)比較在相同藥物處理?xiàng)l件下，DHA及Cis分別對(duì)A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞抑制率的影響。
　　3.采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）來(lái)評(píng)價(jià)DHA作用不同時(shí)間、劑量的情況下，對(duì)H1299細(xì)胞的凋

4、亡率的影響。
　　4.通過(guò)赫斯特33258（Hoechst33258）對(duì)細(xì)胞核染色來(lái)觀察經(jīng)DHA處理后H1299細(xì)胞核的形態(tài)變化。
　　5.通過(guò)蛋白印跡法（Western Blot）和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）來(lái)評(píng)價(jià)凋亡相關(guān)通路蛋白及基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.MTT實(shí)驗(yàn)和Hoechst33258細(xì)胞核染色實(shí)驗(yàn)顯示隨著各自藥物濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)雙氫青蒿素和順鉑單藥處理組細(xì)胞凋

5、亡率明顯增加，聯(lián)合用藥處理組的細(xì)胞凋亡率更高。另一個(gè)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相同濃度的Cis孵育A549及H1299兩組細(xì)胞48小時(shí)后，對(duì)A549細(xì)胞的抑制率明顯高于對(duì)H1299細(xì)胞的抑制率。于此相反，使用相同濃度的DHA孵育上述兩組細(xì)胞48小時(shí)后，兩組間的細(xì)胞抑制率均無(wú)明顯差異；
　　2.流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示當(dāng)DHA濃度為20μM時(shí)，H1299細(xì)胞的凋亡率從9.09%（對(duì)照組）上升至17.07%（24小時(shí)）以及24.31%（48小時(shí)

6、）；當(dāng)DHA作用于相同時(shí)間（24小時(shí)），其引起細(xì)胞的凋亡率從9.09%（對(duì)照組）上升至17.07%（濃度為20μM）以及22.5%（濃度為40μM）；
　　3.RT-qPCR的結(jié)果顯示單藥DHA（20μM）、Cis（12.5μM）及兩藥聯(lián)合孵育24小時(shí)及48小時(shí)，H1299細(xì)胞中半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3、-8、-9mRNA的表達(dá)均上調(diào)，其中聯(lián)合用藥組Caspase-3，-8，-9的2-??Ct值高于單藥組，而單藥組

7、Caspase3，8，9的2-??Ct值高于對(duì)照組；
　　4.Western Blot結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組能顯著提高Caspase-8，-9，-3，-6，-7和多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的活性。提前在H1299細(xì)胞中加入Caspase-3、-8、-9抑制劑后，再次通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)觀察這三個(gè)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明提前加入zDQMD-fmk組的細(xì)胞，Cleave-caspase-3的表達(dá)明顯降低，但是Cleav

8、e-caspase-8、-9的表達(dá)無(wú)明顯變化。而提前加入zIETD-fmk組的細(xì)胞，顯著降低了Cleave-caspase-8的表達(dá)，部分降低了Cleave-caspase-3、-9的表達(dá)。提前孵育zLEHD-fmk組的細(xì)胞Cleave-caspase-9的表達(dá)顯著降低，Cleave-caspase-3的表達(dá)部分降低，而Cleave-caspase-8的表達(dá)基本無(wú)變化。
　　結(jié)論：
　　1.DHA作用于H1299細(xì)胞能誘導(dǎo)時(shí)

9、間及劑量依賴性細(xì)胞毒性。
　　2.DHA作用于H1299細(xì)胞能誘導(dǎo)時(shí)間及劑量依賴性的細(xì)胞凋亡。
　　3.DHA聯(lián)合Cis作用于H1299細(xì)胞有協(xié)同促凋亡作用。
　　4.Caspase-8參與的死亡受體信號(hào)通路及Caspase-9參與的線粒體信號(hào)通路與DHA及CIS聯(lián)合用藥產(chǎn)生的協(xié)同作用有關(guān)。
　　5.DHA及Cis單藥及聯(lián)合用藥均能上調(diào)H1299細(xì)胞Caspase-3，-8，-9mRNA的表達(dá)。
　　綜上所