二氫青蒿素對HIF-1α介導(dǎo)的肺腺癌血管化調(diào)控及其對順鉑增敏效應(yīng)的機制研究.pdf

1、腫瘤組織中普遍存在著缺氧狀態(tài)。缺氧誘導(dǎo)因子-lα(hypoxia-induciblefactor-lalpha，HIF-lα)是缺氧狀態(tài)時廣泛存在的一種轉(zhuǎn)錄因子，在介導(dǎo)腫瘤缺氧反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)是HIF-lα重要的靶基因，是一種內(nèi)皮細(xì)胞專一性絲裂原和血管新生強烈的刺激因子，是惡性腫瘤誘導(dǎo)血管生成的重要調(diào)控因子。除了腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生一系列的缺

2、氧適應(yīng)性反應(yīng)外，在腫瘤組織缺氧區(qū)域中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞聚集在血管生成中也具有重要作用。環(huán)氧化酶2(Cycloxygenase-2，COX-2)為前炎性因子，通常在組織缺氧或損傷反應(yīng)中由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，COX-2的代謝產(chǎn)物PGE2和PGI2通過活化VEGF而直接刺激血管生成。
　　 血管生成是指從現(xiàn)有的微血管系統(tǒng)中生成新血管的過程。由于機體對腫瘤的制約能力差，腫瘤內(nèi)部血管大量形成，但腫瘤血管通常是擴張的，形狀呈不規(guī)則扭曲，

3、具有與正常血管不同的多重特征。近年來Jain等提出，抗血管生成療法能使非正常結(jié)構(gòu)和功能的腫瘤血管趨向正常化，從而有利于氧氣和藥物進(jìn)入腫瘤，增強腫瘤對藥物的敏感性。已有臨床前和臨床研究資料顯示，抗血管生成藥物輔助化療藥物的療法能大大增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。
　　 青蒿素(artemisinin)是我國科學(xué)家首次從植物黃花蒿Artemisia annua Linn中提取的一種新型的倍半萜內(nèi)酯。本課題組的前期研究表明，二氫青蒿

4、素(dihydroartemisinin，DHA)等青蒿素類藥物能抑制肺癌(Lewis)、人多發(fā)性骨髓瘤(RPMI8226)以及人白血病(K562，HL60)等多種惡性腫瘤的VEGF或VEGF受體KDR/flk-1表達(dá)，具有潛在的抗腫瘤血管生成作用。最近又在lewis肺癌動物模型證實，二氫青蒿素能增強環(huán)磷酰胺對Lewis肺癌生長和轉(zhuǎn)移的治療作用，獲得良好的實驗性治療效果。從缺氧到VEGF表達(dá)增多的過程中HIF-lα起到了橋梁作用，對于二

5、氫青蒿素是否通過調(diào)控VEGF的上游基因HIF-lα而下調(diào)VEGF表達(dá)還未見報道。本論文采用A549與A549/DDP肺腺癌荷瘤動物模型研究二氫青蒿素增強順鉑對A549與A549/DDP肺腺癌生長的治療作用，并進(jìn)一步從細(xì)胞，組織以及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞三個方位分析兩藥合用對HIF-lα介導(dǎo)的肺腺癌血管化的調(diào)控作用，從細(xì)胞增殖和凋亡兩個方向分析二氫青蒿素與順鉑合用對A549和A549/DDP肺腺癌細(xì)胞的協(xié)同作用。旨在探討青蒿素類藥物增強化療藥物

6、抗腫瘤作用的內(nèi)在相關(guān)因素和時效規(guī)律，從細(xì)胞分子水平研究其增強順鉑治療作用的可能機制，為評價二氫青蒿素的抗腫瘤作用及臨床應(yīng)用前景提供更有力的藥理學(xué)依據(jù)。
　　 結(jié)果：
　　 1.二氫青蒿素增強順鉑對A549及A549/DDP肺腺癌的治療作用
　　 1.1抑制腫瘤生長
　　 實驗結(jié)果表明，在荷A549肺腺癌小鼠腫瘤模型中，三個劑量的二氫青蒿素聯(lián)合順鉑用藥組的腫瘤生長速度緩慢，體積增長速度較溶劑對照組與二氫青蒿

7、素單用組及順鉑單用組緩慢，且在治療結(jié)束后腫瘤重量均較溶劑對照組明顯減少(p<0.001)。這種聯(lián)合用藥的治療效果在耐順鉑的荷A549/DDP肺腺癌模型更佳，各組與溶劑對照組相比都有顯著性差異(p<0.001)，且其中各合用組與各相應(yīng)的單用二氫青蒿素組，單用順鉑組相比均有明顯差異(p<0.05)。
　　 1.2藥物的毒副作用
　　 用藥期間，各組荷瘤小鼠活動良好，未見特殊不良反應(yīng)，無一例死亡。荷A549肺腺癌小鼠用藥12天

8、后，溶劑對照組及治療各組小鼠去瘤體重?zé)o顯著差異。荷A549/DDP肺腺癌小鼠用藥28天后，對照組及治療各組小鼠去瘤體重比較也無顯著差異。說明在本實驗的給藥方案下藥物對小鼠沒有明顯的毒副作用。
　　 1.3荷A549/DDP肺腺癌模型腫瘤組織/血漿中順鉑含量
　　 等離子體發(fā)射光譜分析測定表明，在荷A549/DDP肺腺癌小鼠的腫瘤組織中，三個劑量的二氫青蒿素聯(lián)合順鉑，使腫瘤組織中順鉑含量明顯遞增，在二氫青蒿素劑量0～100

9、mg/kg的范圍內(nèi)，腫瘤組織中順鉑含量與二氫青蒿素劑量呈良好的線性關(guān)系，r=0.9993。隨腫瘤組織中順鉑含量遞增，腫瘤重量呈遞減趨勢。
　　 2.二氫青蒿素增強順鉑抑制低氧環(huán)境A549及A549/DDP肺腺癌細(xì)胞生長
　　 2.1抑制A549及A549/DDP肺腺癌細(xì)胞增殖作用
　　 MTT實驗結(jié)果表明，用二氫青蒿素和順鉑處理48h后，A549與A549/DDP細(xì)胞增殖均被明顯抑制，特別在兩藥合用組中細(xì)胞的抑制

10、尤為明顯，且隨藥物濃度增加抑制率呈遞增趨勢。通過Caculsyn2.0軟件計算得到二氫青蒿素和順鉑兩藥合用的協(xié)同系數(shù)CI值，在A549細(xì)胞中平均值為0.6706，在A549/DDP細(xì)胞中平均值為0.5674，均小于1，說明二氫青蒿素和順鉑聯(lián)合應(yīng)用能對A549與A549/DDP細(xì)胞發(fā)揮協(xié)同抑制作用。
　　 2.2誘導(dǎo)A549及A549/DDP肺腺癌細(xì)胞凋亡的流式定量分析
　　 經(jīng)流式細(xì)胞儀分析得，A549細(xì)胞經(jīng)5.68mg

11、/L二氫青蒿素，3.75mg/L順鉑作用48h后，細(xì)胞凋亡百分率有明顯增加。特別是二氫青蒿素與順鉑合用組的凋亡率高達(dá)65.70％(P<0.001)。A549/DDP細(xì)胞經(jīng)11.36mg/L二氫青蒿素，7.5mg/L順鉑作用48h后，細(xì)胞凋亡百分率亦有明顯增加。特別是二氫青蒿素與順鉑合用組的凋亡率高達(dá)60.00％(P<0.001)，
　　 3.二氫青蒿素對HIF-lα介導(dǎo)的肺腺癌血管化的調(diào)控研究
　　 3.1下調(diào)低氧環(huán)境A

12、549及A549/DDP肺腺癌細(xì)胞HIF-lα和VEGF蛋白表達(dá)
　　 Western blotting實驗表明，二氫青蒿素能顯著下調(diào)A549細(xì)胞及A549/DDP細(xì)胞HIF-lα，VEGF蛋白的表達(dá)，在與順鉑的合用組中下調(diào)作用尤為明顯，且呈作用時間依賴性。在A549細(xì)胞中，當(dāng)藥物作用12h，HIF-lα，VEGF蛋白在給藥組中的表達(dá)與溶劑對照組無顯著性差異；作用24h后，合用組中HIF-lα和VEGF蛋白表達(dá)量相對于溶劑對照組

13、分別下降了42.7％、44.3％(P<0.01，P<0.01)；作用48h后，則合用組中HIF-lα和VEGF蛋白表達(dá)量相對于溶劑對照組分別下降了61.6％、78.0％(P<0.001， P<0.01)。
　　 在A549/DDP細(xì)胞中，當(dāng)藥物作用12h，HIF-lα，VEGF蛋白在給藥組中的表達(dá)與溶劑對照組無顯著性差異；作用24h后，合用組中HIF-lα和VEGF蛋白表達(dá)量相對于溶劑對照組分別下降了37.2％、29.6％(P<

14、0.05，P<0.05)；作用48h后，則合用組中HIF-lα和VEGF蛋白表達(dá)量相對于溶劑對照組分別下降了54.1％、41.9％(P<0.01， P<0.05)。
　　 3.2下調(diào)A549及A549/DDP肺腺癌組織HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)
　　 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，HIF-lα與VEGF蛋白在A549肺腺癌移植瘤的溶劑對照組中均呈中等陽性表達(dá)，在順鉑單用組中的表達(dá)量稍弱于溶劑對照組，各二氫青蒿素單用組及兩

15、藥合用組腫瘤細(xì)胞內(nèi)兩蛋白均呈弱陽性表達(dá)。在A549/DDP肺腺癌移植瘤的溶劑對照組中HIF-lα和VEGF蛋白都呈強陽性表達(dá)，順鉑單用組中兩蛋白的表達(dá)量與溶劑對照組相近，然而在各二氫青蒿素單用組及兩藥合用組中HIF-lα與VEGF蛋白均呈弱陽性表達(dá)。
　　 3.3下調(diào)A549及A549/DDP肺腺癌組織COX-2蛋白表達(dá)
　　 COX-2蛋白在A549肺腺癌移植瘤的溶劑對照組表達(dá)呈中等陽性，在順鉑單用組中表達(dá)量稍弱于溶劑

16、對照組，而在各二氫青蒿素單用組及兩藥合用組腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量極弱。在A549/DDP肺腺癌移植瘤的溶劑對照組中COX-2蛋白呈強陽性表達(dá)，在順鉑單用組及各二氫青蒿素單用組中則呈中等陽性表達(dá)，而在各兩藥合用組中表達(dá)極弱。
　　 3.4抑制腫瘤組織徼血管密度
　　 以內(nèi)皮細(xì)胞特異標(biāo)記物CD31蛋白作為微血管定量指標(biāo)，觀察統(tǒng)計結(jié)果表明，在A549和A549/DDP移植瘤組織，各二氫青蒿素單用組的微血管數(shù)量與溶劑對照相比較均有顯著

17、性下降(P<0.05或P<0.01)，同時二氫青蒿素與順鉑合用組的微血管密度與各自的單用組相比也有顯著下降(P<0.05或P<0.001)。以腫瘤組織NG2蛋白多糖作為成熟微血管定量指標(biāo)，經(jīng)微血管計數(shù)表明，在A549和A549/DDP移植瘤組織中各二氫青蒿素單用組的微血管數(shù)量與溶劑對照組相比均有顯著性下降(P<0.05或P<0.01)，且二氫青蒿素與順鉑合用組的微血管密度與溶劑對照組以及順鉑單用組相比都有顯著性下降(P<0，05或P<0

18、.01)。
　　 以上研究結(jié)果表明：(1)二氫青蒿素與順鉑合用能有效抑制A549及A549/DDP肺腺癌移植瘤的生長；下調(diào)腫瘤組織內(nèi)HIF-lα，COX-2，VEGF；抑制腫瘤組織新生微血管與成熟微血管密度；能明顯遞增腫瘤組織中順鉑含量。(2)二氫青蒿素與順鉑合用能有效增強對低氧環(huán)境培養(yǎng)的A549及A549/DDP肺腺癌細(xì)胞的毒性作用。
　　 結(jié)論：二氫青蒿素能增強順鉑對A549及A549/DDP肺腺癌的治療作用，其機制