小劑量衣霉素對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響及機制的研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著人們生活方式的改變,特別是高脂高糖飲食,冠心病的發(fā)病率急劇上升,急性冠狀動脈綜合征(Acute coronary syndrome,ACS)作為冠心病的一種急危重癥,嚴重危害了人類的健康。大量文獻報道,冠狀動脈內斑塊的形成及其穩(wěn)定性是決定ACS是否發(fā)生的重要因素,因此,ACS發(fā)生形成的重要基礎是不穩(wěn)定斑塊(unstable plaque,UP),并且UP的破裂及血栓形成是ACS最終引起惡性心血管事件發(fā)生的主要原

2、因。所以,為了臨床防治 ACS,提高患者生存質量;改善疾病預后,降低其死亡率,對不穩(wěn)定斑塊的形成以及破裂的研究至關重要。然而,目前斑塊“不穩(wěn)定性”的具體機制仍不明確。
　　眾多研究顯示,巨噬細胞凋亡是造成動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的重要因素,在晚期動脈粥樣硬化中,巨噬細胞凋亡與內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的發(fā)生密切相關。ERS是指某些原因引起的細胞內質網內穩(wěn)態(tài)失衡、生理功能紊亂的過程。

3、傳統(tǒng)觀點及本課題組前期的研究均表明持久或和較為嚴重的ERS會誘導凋亡瀑布反應,促進CHOP、JNK等分子表達和活化,最終引起細胞凋亡;然而適度的ERS可促進錯誤折疊和未折疊蛋白質降解等方式使應激得到緩解。最新研究報道發(fā)現(xiàn),適度的ERS可通過激活自噬,減少心肌組織的缺血再灌注損傷。那么適度ERS對AS有何影響目前尚不清楚。
　　自噬(Autophagy)是由溶酶體系統(tǒng)降解長半衰期蛋白和細胞器的代謝途徑,可被饑餓、細胞分化和正常的生長

4、調節(jié)激活,主要為了保持細胞內環(huán)境穩(wěn)定和存活。以往研究表明,激活巨噬細胞自噬顯著增加動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性,然而,在動脈粥樣硬化的發(fā)展過程中,內質網應激和自噬的關系以及最終對斑塊穩(wěn)定性的影響尚不清楚。衣霉素是內質網應激的一種明確的激活劑,因此,我們以ApoE基因敲除(ApoE-/-)動脈粥樣硬化小鼠為研究對象,建立不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊模型,觀察不同劑量衣霉素引起的內質網應激對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響,且觀察內質網應激和自噬的狀態(tài)。

5、體外應用不同劑量衣霉素對巨噬細胞進行干預,檢測不同程度內質網應激對泡沫細胞形成的影響以及自噬在其中可能起到的作用。
　　研究目的：
　　1.體外構建ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊模型,觀察不同劑量衣霉素對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響,且觀察內質網應激和自噬的狀態(tài);
　　2.離體構建泡沫細胞模型,模擬動脈粥樣硬化斑塊形成過程,觀察不同劑量衣霉素對泡沫細胞形成的影響;
　　3.探討不同劑量衣霉素影響泡沫細胞

6、形成的機制,尤其是自噬在其中可能起到的作用
　　實驗方法：
　　1.取6-8周的ApoE-/-小鼠40只,給予高脂喂養(yǎng)1周后,隨機將小鼠分為:對照組和手術組。手術組小鼠行右側頸總動脈套管術（Perivascular carotid collar placement,PCCP),術后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)9周。9周末取對照組和手術組小鼠頸動脈,H&E染色觀察小鼠頸動脈斑塊形成情況。
　　2.為了觀察不同劑量衣霉素對動脈粥樣硬化斑塊

7、穩(wěn)定性的影響,將小鼠分為四組:正常對照組、單純PCCP組、小劑量衣霉素組和大劑量衣霉素組。正常對照組和單純PCCP組給予生理鹽水腹腔注射,小劑量衣霉素組和大劑量衣霉素組分別給予小劑量衣霉素、大劑量衣霉素腹腔注射。2周后,處死小鼠,通過H&E染色觀察頸動脈斑塊形態(tài),油紅O染色觀察斑塊內脂質聚集,抗巨噬細胞免疫組化染色觀察斑塊內巨噬細胞聚集,Western-blot檢測內質網應激標志蛋白GRP78和自噬標志蛋白Atg7、p62的表達水平。<

8、br>　　3.體外培養(yǎng)巨噬細胞RAW264.7,建立巨噬細胞泡沫細胞模型。為了觀察不同劑量衣霉素對巨噬細胞的影響,將細胞隨機分為4組:(1)正常對照組,(2)ox-LDL組,(3)ox-LDL+0.1TM組,(4)ox-LDL+1.0TM組;進而深入研究小劑量衣霉素影響泡沫細胞形成的具體機制及其與自噬的關系,將細胞隨機分為5組:(1)正常對照組,(2)ox-LDL組,(3)ox-LDL+0.1TM組,(4)ox-LDL+0.1TM+3-

9、MA組,(5)ox-LDL+Rapa組;分別通過油紅O染色檢測泡沫細胞含量,TUNEL檢測巨噬細胞凋亡以及 Western-blot檢測內質網應激標志蛋白 GRP78和自噬標志蛋白Atg7、p62的表達水平。
　　實驗結果：
　　1.行PCCP手術的ApoE-/-小鼠通過高脂喂養(yǎng)9周后,H&E染色結果顯示:手術組小鼠頸動脈內發(fā)現(xiàn)內部脂質池較大的動脈粥樣硬化斑塊,而對照組小鼠無斑塊形成,其頸動脈管壁光滑。以上表明建模成功。

10、r>　　2.H&E染色結果顯示:與單純 PCCP組和大劑量衣霉素組相比,小劑量衣霉素組頸動脈腔內的斑塊脂質池減少,斑塊結構較為完整且相對穩(wěn)定;油紅O染色結果顯示:小劑量衣霉素組斑塊內脂質含量顯著降低(P<0.05 vs單純PCCP組和大劑量衣霉素組);巨噬細胞免疫組化染色顯示:與單純PCCP組和大劑量衣霉素組相比,小劑量衣霉素組斑塊內巨噬細胞的含量顯著降低（P<0.05),Western-blot結果顯示:小劑量衣霉素干預誘導的一定程度

11、的內質網應激可以適度上調自噬(P<0.05 vs單純PCCP組和大劑量衣霉素組)。
　　3.油紅O染色與TUNEL結果顯示:50 mg/L的ox-LDL可以成功模擬巨噬細胞泡沫化,發(fā)現(xiàn)大量富含紅色脂滴顆粒的巨噬細胞,并且誘導了巨噬細胞凋亡(P<0.01 vs正常對照組),而小劑量衣霉素干預后,巨噬細胞內紅色脂滴顆粒顯著減少且巨噬細胞凋亡減少(P<0.01 vs ox-LDL),而小劑量衣霉素的作用被自噬抑制劑3-MA抑制自噬后顯著

12、減弱(P<0.01 vs0.1TM+ox-LDL),但自噬誘導劑雷帕霉素又可模擬小劑量衣霉素的保護作用。
　　4.ox-LDL干預細胞后,GRP78和p62蛋白表達水平上調,Atg7蛋白表達水平下調(P<0.05 vs正常對照組)。小劑量衣霉素干預后,GRP78和p62蛋白表達水平顯著下調,Atg7蛋白表達水平顯著升高(P<0.05 vs ox-LDL and1.0TM+ox-LDL)。小劑量衣霉素的作用由于自噬抑制劑3-MA的加

13、入,被顯著減弱,Atg7蛋白表達水平下調,p62蛋白表達水平相應上調（P<0.05 vs0.1TM+ox-LDL),而GRP78的蛋白表達水平變化不明顯;自噬誘導劑Rapa干預后p62蛋白表達水平顯著下調、Atg7蛋白表達水平上調,GRP78蛋白表達無顯著差異。
　　結論：
　　1.成功構建了不穩(wěn)定性較高的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊模型;
　　2.小劑量衣霉素預處理ApoE-/-小鼠可以減小頸動脈腔內的斑塊脂質