鐵調(diào)素調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊形成是心腦血管疾病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)。大量證據(jù)表明，鐵在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在人及新西蘭大白兔的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處，均發(fā)現(xiàn)鐵沉積明顯增多，而在給予鐵螯合劑治療后，動(dòng)脈粥樣硬化的情況有明顯好轉(zhuǎn)。斑塊內(nèi)的鐵沉積總是與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和泡沫細(xì)胞的出現(xiàn)密切相關(guān)。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的過程中，鐵作為一種強(qiáng)氧化劑，可以通過Haber-Weiss反應(yīng)催化產(chǎn)生大

2、量活性氧，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷蛋白質(zhì)和（或）核酸，促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡并釋放出大量細(xì)胞內(nèi)容物，這些物質(zhì)可以進(jìn)一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞的侵潤(rùn)，使脂質(zhì)過氧化反應(yīng)不斷放大。
　　 鐵調(diào)素(hepcidin，Hep)是近年發(fā)現(xiàn)的一種在肝臟合成并富含半胱氨酸的抗菌多肽，具有抑制腸道鐵吸收和單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)鐵釋放的作用，是一種重要的負(fù)性鐵調(diào)節(jié)激素。膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(ferroportinl，F(xiàn)P1)是巨噬細(xì)胞膜上已知唯一的鐵輸出蛋白。Hep與巨

3、噬細(xì)胞表面的FP1結(jié)合后，促進(jìn)其內(nèi)吞和降解，使巨噬細(xì)胞內(nèi)的鐵增多，氧化作用增強(qiáng)。Hep的表達(dá)受炎性因子的調(diào)節(jié)，發(fā)生炎癥或感染時(shí)，一些細(xì)胞因子表達(dá)量增加促進(jìn)鐵調(diào)素基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵平衡。LPS、Interleukin-6(IL-6)、Interleukin-1（IL-1）均可促進(jìn)體內(nèi)Hep水平的升高。
　　 2007年，SullivanJL等人提出了鐵調(diào)素與動(dòng)脈粥樣硬化之間具有相關(guān)性的假說。新近的研究證實(shí)，鐵調(diào)素與代謝綜合征

4、具有相關(guān)性，認(rèn)為在大約15％的代謝綜合征患者中存在鐵的超負(fù)荷，而這些患者中，大約50％的患者同時(shí)患有非酒精源性脂肪肝。近期，ValentiL等人的臨床研究發(fā)現(xiàn)，在代謝綜合征患者中，血清鐵調(diào)素水平與血清MCP-1水平及血管損害程度相關(guān)，但對(duì)其發(fā)生機(jī)制未作進(jìn)一步探討。
　　 綜上所述，盡管大量數(shù)據(jù)支持鐵代謝與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系以及鐵調(diào)素對(duì)體內(nèi)鐵代謝的調(diào)控作用，當(dāng)尚未獲得鐵調(diào)素與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性的直接證據(jù)。本論文擬通過建

5、立ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，并分別在動(dòng)物體內(nèi)過表達(dá)和干擾鐵調(diào)素基因，觀察鐵調(diào)素水平上調(diào)及干擾對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響并探討其分子機(jī)制，從而明確鐵調(diào)素在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展及斑塊不穩(wěn)定中的作用。
　　 目的：
　　 1.觀察鐵調(diào)素在ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)水平，明確斑塊內(nèi)鐵調(diào)素表達(dá)的細(xì)胞類型;
　　 2.在ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中，以基因干預(yù)的方法，明確鐵調(diào)素對(duì)動(dòng)脈粥樣

6、硬化斑塊穩(wěn)定性的影響;
　　 3.探討鐵調(diào)素導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定的可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、重組腺病毒干擾載體與表達(dá)載體的的構(gòu)建及擴(kuò)增
　　 擴(kuò)增小鼠hepcidin基因，PCR產(chǎn)物與pMD18Tsimple載體連接，以EcoRI和BamHI為酶切位點(diǎn)，連接pMD18Tsimple-hamp和pIRES2-EGFP載體，保留測(cè)序驗(yàn)證正確的pIRES2-EGFP-Hamp;設(shè)計(jì)針對(duì)hepcidin的sh

7、RNA，插入到miRNA表達(dá)載體pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中，保留測(cè)序驗(yàn)證正確的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-hamp。將pIRES2-EGFP-Hamp和pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-hamp分別與腺病毒表達(dá)的目的載體pAD/CMV/V5-DEST進(jìn)行LR重組反應(yīng)，以獲得含目的基因序列或目的基因干擾片段-GFP的腺病毒表達(dá)載體。將含目的基因序列的腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，包裝并純

8、化病毒。通過超速離心及層析的方法濃縮及純化病毒，獲得病毒濃縮液。僅表達(dá)EGFP的腺病毒載體作為對(duì)照。
　　 2、動(dòng)物模型的建立及腺病毒轉(zhuǎn)染
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為兩部分進(jìn)行。在第1部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，40只6周齡的雄性ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，對(duì)照組給予全程普通飲食，模型組全程高脂飲食喂養(yǎng)并在第2周末行左頸總動(dòng)脈套管術(shù)。兩組動(dòng)物均于第13周末處死。在第2部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，75只6周齡的雄性ApoE-/-小鼠全程給予

9、高脂飲食喂養(yǎng)，第2周末行左頸總動(dòng)脈套管術(shù)，術(shù)后8周隨機(jī)分為3組并分別轉(zhuǎn)染攜帶EGFP，EFP-hepcidin，和EGFP-hepcidinshRNA的重組腺病毒。3組動(dòng)物繼續(xù)高脂喂養(yǎng)3周后于第13周末處死。
　　 3、血清指標(biāo)檢測(cè)
　　 第2部分動(dòng)物處死前心臟采血，檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及血糖水平;同時(shí)檢測(cè)3組動(dòng)物血清中鐵及鐵調(diào)素的水平。
　　

10、 4、組織病理與免疫組化檢測(cè)
　　 對(duì)左側(cè)頸動(dòng)脈斑塊分別進(jìn)行H&E染色、油紅O染色、天狼猩紅染色，并通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)斑塊內(nèi)膠原、脂質(zhì)、巨噬細(xì)胞(MOMA-2)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-actin)含量。測(cè)量斑塊面積，觀察斑塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，計(jì)算易損指數(shù)。易損指數(shù)=（巨噬細(xì)胞+脂質(zhì)）陽性面積百分比/（平滑肌細(xì)胞+膠原）陽性面積百分比。
　　 通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)斑塊內(nèi)炎性因子IL-6、MCP-1、TNFα、MMP-2以

11、及鐵相關(guān)蛋白hepcidin、H-Ferritin、L-Ferritin的表達(dá)水平。
　　 5、免疫熒光化學(xué)檢測(cè)
　　 以免疫雙標(biāo)的方法檢測(cè)Hepcidin在斑塊巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的表達(dá);同樣方法檢測(cè)ox-LDL在3組斑塊巨噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
　　 6、non-Heme鐵檢測(cè)
　　 取新鮮頸動(dòng)脈斑塊組織，以原子吸收分光光度儀法檢測(cè)3組斑塊內(nèi)non-heme鐵含量。
　　 7、實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢

12、測(cè)
　　 取新鮮頸動(dòng)脈斑塊組織，提取RNA，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)Hepcidin、H-Ferritin、L-Ferritin、IL-6、MCP-1、TNF-a、MMP-2等指標(biāo)在mRNA水平的表達(dá)情況;取新鮮肝臟組織，提取RNA，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)3組動(dòng)物肝臟HepcidinmRNA水平的表達(dá)情況。
　　 8、統(tǒng)計(jì)分析
　　 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均使用SPSS16.0軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表

13、示，計(jì)數(shù)資料以數(shù)值和百分比表示。統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)、OnewayANOVA或LSDpost-hoc分析。P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功構(gòu)建重組腺病毒干擾載體與表達(dá)載體
　　 經(jīng)重組腺病毒載體測(cè)序驗(yàn)證，Hep腺病毒表達(dá)載體及干擾載體構(gòu)建正確，病毒包裝成功，表達(dá)載體的病毒滴度為3.11×1012ifu/ml，干擾載體的病毒滴度為9.12×1012ifu/ml。
　　 2、

14、鐵調(diào)素在ApopE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)情況及細(xì)胞定位
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的第1部分結(jié)果顯示，Hepcidin在對(duì)照組頸動(dòng)脈血管內(nèi)幾乎不表達(dá)，但在模型組頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)存在mRNA和蛋白水平的高表達(dá)。兩組之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。鐵調(diào)素主要在斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞未見鐵調(diào)素表達(dá)。
　　 3、腺病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率
　　 腺病毒局部轉(zhuǎn)染1周末GFP表達(dá)量明顯增加，兩周達(dá)到高峰，然后開始衰減，3周末實(shí)

15、驗(yàn)結(jié)束時(shí)，斑塊內(nèi)仍可見GFP表達(dá);轉(zhuǎn)染兩周后，GFP陽性面積與斑塊面積的平均比值在EGFP組、EGFP-Hep組及EGFP-Hep-shRNA組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4、腺病毒轉(zhuǎn)染前后小鼠體重測(cè)量
　　 轉(zhuǎn)染前后各組間小鼠體重?zé)o明顯差異。
　　 5、血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果
　　 各組小鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血糖未見統(tǒng)

16、計(jì)學(xué)差異，鐵調(diào)素基因干預(yù)對(duì)血脂、血糖水平無明顯影響。
　　 6、血清鐵水平檢測(cè)結(jié)果
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，血清鐵水平在三組間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 7、血清及肝臟Hepcidin水平檢測(cè)結(jié)果
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，ELISA檢測(cè)血清hepcidin水平，三組間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;各組小鼠肝臟Hepcidin在mRNA水平的表達(dá)無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 8、斑塊內(nèi)Hepcidin表達(dá)檢測(cè)結(jié)果
　　

17、EGFP-Hep組與對(duì)照組相比，hepcidin的表達(dá)在蛋白和mRNA水平均升高，EGFP-Hep-shRNA組與對(duì)照組相比，hepcidin的表達(dá)在蛋白和mRNA水平均降低。
　　 9、斑塊面積檢測(cè)結(jié)果
　　 三組小鼠頸動(dòng)脈斑塊面積平均值無顯著差異。
　　 10、斑塊成分檢測(cè)及易損指數(shù)測(cè)量結(jié)果
　　 油紅O染色檢測(cè)斑塊內(nèi)脂質(zhì)成分，EGFP、EGFP-Hep和EGFP-Hep-shRNA三組脂質(zhì)含量無顯著

18、差異;天狼猩紅染色檢測(cè)斑塊內(nèi)膠原成分，EGFP-Hep組較對(duì)照組膠原含量顯著減少，EGFP-Hep-shRNA組較對(duì)照組膠原含量顯著增加;MOMA-2免疫組化檢測(cè)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞，EGFP-Hep組較對(duì)照組巨噬細(xì)胞含量顯著增加，EGFP-Hep-shRNA組較對(duì)照組巨噬細(xì)胞含量顯著減少;α-SMactin免疫組化檢測(cè)斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞，EGFP-Hep組較對(duì)照組平滑肌細(xì)胞含量顯著減少，EGFP-Hep-shRNA組較對(duì)照組平滑肌細(xì)胞含量顯著

19、增多;EGFP-Hep組易損指數(shù)較對(duì)照組顯著增加，EGFP-Hep-shRNA組較對(duì)照組易損指數(shù)顯著降低。
　　 11、斑塊內(nèi)炎性因子檢測(cè)結(jié)果
　　 EGFP-Hep組IL-6、MCP-1、TNF-α和MMP-2的表達(dá)，無論在蛋白水平還是mRNA水平，較對(duì)照組均明顯升高(P＜0.05);反之，EGFP-Hep-shRNA組IL-6、MCP-1、TNF-α和MMP-2的表達(dá)，無論在蛋白水平還是mRNA水平，較對(duì)照組均明顯降

20、低（P＜0.05）。
　　 12、ox-LDL在巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果
　　 免疫熒光雙標(biāo)及激光共聚焦顯微鏡觀察ox-LDL在EGFP、EGFP-Hep和EGFP-Hep-shRNA三組巨噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)百分比，EGFP-Hep組較對(duì)照組顯著升高，EGFP-Hep-shRNA組較對(duì)照組顯著降低。
　　 13、斑塊內(nèi)鐵蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果
　　 EGFP-Hep組L-Ferritin和H-Ferritin

21、的表達(dá)，無論在蛋白水平還是mRNA水平，較對(duì)照組均明顯升高;EGFP-Hep-shRNA組L-Ferritin和H-Ferritin的表達(dá)，無論在蛋白水平還是mRNA水平，較對(duì)照組均明顯降低。
　　 14、斑塊內(nèi)non-heme鐵檢測(cè)結(jié)果
　　 原子吸收分光光度儀檢測(cè)斑塊內(nèi)non-heme鐵的水平。EGFP-Hep組較對(duì)照組明顯升高;EGFP-Hep-shRNA組較對(duì)照組明顯降低。
　　 結(jié)論：
　　 1