恩度對血管內皮細胞的影響及其與多西他賽聯(lián)合作用的觀察.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分、恩度對內皮細胞活化標志的影響及其與多西他賽聯(lián)合作用的觀察 目的： 1.通過體外實驗，模擬血管內皮細胞的活化、增殖狀態(tài)。 2.檢測恩度、多西他賽、恩度+多西他賽對不同生長狀態(tài)的人臍靜脈內皮細胞活化標志的影響并研究其作用機制。 3.觀察恩度、多西他賽、恩度+多西他賽對人臍靜脈內皮細胞的增殖、凋亡及細胞周期的影響，并進一步探討相關機制。 4.研究恩度與多西他賽的聯(lián)合

2、對內皮細胞是否具有協(xié)同作用，如果有，則進一步探討聯(lián)合用藥的時間、順序及劑量與效應的關系，探索相關機制，以指導臨床用藥。 方法： 1.應用流式細胞術分別檢測對數(shù)生長期及TNF-α作用后的HUVEC細胞表面標志物CD146、CD105的變化情況； 2.應用流式細胞術分別檢測恩度、多西他賽、恩度+多西他賽作用于對數(shù)生長期及TNF-α作用后的HUVEC細胞后，其表面標志物CD146、CD105的變化情況； 3.應

3、用流式細胞術檢測VEGF作用后的HUVEC細胞經不同給藥方案作用后，其表面標志物CD146、CD105和CD62E的變化情況； 4.應用MTT法測定藥物對HUVEC細胞的增殖抑制率； 5.應用流式細胞術檢測細胞凋亡率和細胞周期； 6.應用SPSS13．0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，分析HUVEC細胞表面標志物與藥物作用間的關系。 結果： 1.不同狀態(tài)HUVEC細胞經藥物作用后，表面標志物CD14

4、6、CD105的檢測結果： （1）CD146的變化： 1）對數(shù)生長期HUVEC經藥物作用48h：對照、不同濃度恩度單藥與恩度300μg/ml+多西他賽組的CD146表達差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0．05）。 2）對數(shù)生長期HUVEC中：①多西他賽作用24h與48h、24h與72h組；②恩度100μg/ml+多西他賽作用24h與72h組；③恩度300μg/ml+多西他賽作用24h與48h組，CD146表達差異均

5、有統(tǒng)計學意義（均P<0．05）。 3）TNF-α作用后HUVEC經藥物作用48h：①對照與恩度300μg/ml組；②恩度200μg/ml與恩度300μg/ml+多西他賽組；③恩度300μg/ml與恩度300μg/ml+多西他賽組，CD146表達差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0．05）。 （2）CD105的變化： 1）對數(shù)生長期HUVEC經藥物作用48h：①對照與多西他賽組；②對照與恩度300μg/ml+多西他賽組

6、；③恩度100μg/ml與恩度300μg/ml+多西他賽組；④恩度200μg/ml與恩度300μg/ml+多西他賽組⑤恩度100μg/ml+多西他賽與恩度300μg/ml+多西他賽組間，CD105表達差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0．05）。 2）TNF-α作用后的HUVEC經藥物作用24h：對照與多西他賽組、對照與各聯(lián)合給藥組間，CD105表達差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0．05）。 3）TNF-α作用后的HUVEC：多

7、西他賽、三個聯(lián)合給藥組在24h與48h、24h與72h組間，CD105表達差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0．05）。 （3）對數(shù)生長期HUVEC經藥物作用48h后的CD146和CD105的變化趨勢：CD146和CD105表達變化呈線性趨勢，二者之間的相關系數(shù)為0．908（P=0．002）。 （4）TNF-α作用后的HUVEC經藥物作用48h后的CD146和CD105的變化趨勢：CD146和CD105表達變化呈非線性趨勢，二者

8、之間的相關系數(shù)為-0．226（P=0．590）。 2.VEGF作用后的HUVEC細胞經不同給藥方案作用，其表面標志物CD146、CD105和CD62E的檢測結果： （1）CD146的變化： 1）對照或VEGF組與同時給藥、先多西他賽后恩度（序貫給藥1）組間，CD146表達差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0．05）。 2）恩度與多西他賽、同時給藥、序貫給藥1組間，CD146表達差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0．0

9、5）。 3）先恩度后多西他賽（序貫給藥2）與同時給藥、序貫給藥1組間，CD146表達差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0．05）。 （2）CD105的變化：各組間的CD105表達差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0．05）。 （3）CD62E的變化： 1）對照與多西他賽、同時給藥、序貫給藥1組間，CD62E表達差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0．05）。 2）恩度與多西他賽、同時給藥、序貫給藥1組間，CD62E表

10、達差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0．05）。 3）序貫給藥1與VEGF組、序貫給藥2組間，CD62E表達差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0．05）。 3.兩單藥對HUVEC細胞的增殖抑制作用：恩度對HUVEC作用48h后抑制率顯著升高，在96h～120h間穩(wěn)定于較高水平；多西他賽在48h時抑制率明顯升高。 4.不同給藥方案對HUVEC細胞的增殖抑制作用：聯(lián)合較單藥作用更明顯，聯(lián)合效應中，同時給藥的抑制率最高（77．4％）

11、。 5.凋亡檢測提示，先多西他賽后恩度組的凋亡率最高（34．7％）。周期檢測提示，與對照組比較，恩度使G0/G1期細胞比例稍增加；多西他賽使G2/M期細胞比例增加；先多西他賽后恩度組的G0/G1期細胞比例增加；同時給藥使G2/M期細胞比例有所增加；先恩度后多西他賽使G0/G1期細胞比例略增加、G2/M期減少。 結論： 1.一定濃度的恩度及其聯(lián)合多西他賽均可下調對數(shù)生長期內皮細胞的CD146、CD105表達。

12、 2.在內皮細胞過度激活狀態(tài)下，恩度在一定時間內可能促進內皮細胞黏附、而對細胞增殖的抑制作用較弱，隨時間延長，恩度又可誘導細胞凋亡或壞死。多西他賽可直接抑制細胞活化、增殖、黏附，誘導細胞凋亡或壞死。 3.一定濃度恩度聯(lián)合多西他賽抑制細胞活化、增殖、黏附，誘導細胞凋亡或壞死的作用強于單藥，其中同時給藥與先多西他賽后恩度作用更顯著。先恩度后多西他賽作用不及多西他賽單藥，其機制可能與影響細胞周期分布及誘導細胞凋亡等有關。 第

13、二部分、恩度對內皮細胞功能的影響及其與多西他賽聯(lián)合作用的觀察 目的： 1.觀察恩度、多西他賽對人臍靜脈內皮細胞EMMPRIN、MMP-2表達的影響。 2.觀察恩度、多西他賽、恩度+多西他賽對活化血管內皮細胞形成管樣結構的影響。 3.研究恩度與多西他賽聯(lián)合是否具有協(xié)同作用，如果有，則進一步探討聯(lián)合用藥的時間、順序及劑量與效應的關系，以指導臨床。 方法： 1.免疫組化法和Western blo

14、t實驗觀察藥物對HUVEC細胞EMMPRIN、MMP-2蛋白表達的影響； 2.經HUVEC管樣結構形成實驗，倒置相差顯微鏡下觀察活化血管內皮細胞形成管樣結構的能力及藥物對其的影響； 3.應用SPSS13．0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，分析HUVEC細胞功能與藥物作用間的關系。 結果： 1.免疫組化結果顯示，藥物作用后，細胞形態(tài)與密度改變、EMMPRIN與MMP-2表達較對照組減弱。 2.West

15、ern blot實驗顯示，EMMPRIN和MMP-2蛋白在對照組中的表達水平高于多西他賽及恩度單藥組。 3.HUVEC管樣結構形成實驗顯示，恩度單藥在一定時間內可促進HUVEC管樣結構形成，隨作用時間延長，管樣結構形成能力降低；多西他賽可直接抑制管樣結構形成；恩度聯(lián)合多西他賽較單藥抑制作用明顯，其中先多西他賽后恩度和同時給藥組抑制作用更顯著。 結論： 1.一定濃度的恩度與多西他賽均能減弱HUVEC細胞中的EMMP

16、RIN與MMP-2蛋白表達。 2.多西他賽可能因其細胞毒作用較強，可直接抑制內皮細胞活化、增殖、黏附、管樣結構形成，誘導細胞凋亡或壞死，減少血管基底膜降解，降低血管通透性。 3.恩度在一定時間內可能促進內皮細胞黏附，可能會增加內皮細胞募集，促進細胞分化，促進管樣結構形成與分化；其又可減少MMPs對血管基底膜降解，故可能造成血管通透性降低、局部組織間質液壓（IFP）下降及對血管壓力下降、從而使分布紊亂的血管重新排列，提示恩

17、度在一定時間內可能具有血管正?；饔?。但隨作用時間延長，其又可誘導細胞凋亡或壞死，管樣結構形成能力降低，故恩度的血管正?；饔每赡苁嵌唐谛?。 4.先多西他賽后恩度和同時給藥組抑制管樣結構形成作用更明顯，可能一方面是因恩度與多西他賽聯(lián)合作用后，多西他賽顯示出更強的細胞毒性、更高的殺傷及破壞細胞結構能力等。先恩度后多西他賽組的聯(lián)合效應不如先多西他賽后恩度和同時給藥組，可能是因該序貫方式作用后，兩黏附分子表達均上調、有助于管樣結構形