2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、化療是治療惡性腫瘤的重要手段,化學(xué)藥物劑量的增加無疑可以最大程度消除腫瘤患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷及緩解期體內(nèi)微小的腫瘤殘留灶,有助于提高患者的長期無瘤生存率,但其引起的骨髓抑制是造成患者嚴(yán)重感染、出血、死亡的主要原因。如何提高骨髓造血細(xì)胞對(duì)化療的耐受性,一直是人們所關(guān)注的焦點(diǎn)。為此,將耐藥基因?qū)牍撬杓?xì)胞使之獲得耐藥表型以增加骨髓對(duì)化療藥物的耐受性已獲得成功,盡管臨床廣泛應(yīng)用尚存在某些問題,但應(yīng)用潛力很大。其中研究最多的是多藥耐藥基因(mdr

2、1),它可編碼高度糖基化的跨膜蛋白,將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出到細(xì)胞外,降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,因而減少細(xì)胞毒性,將mdr1轉(zhuǎn)染骨髓造血細(xì)胞的化療保護(hù)作用在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到證實(shí),但臨床應(yīng)用尚不理想,同時(shí)轉(zhuǎn)染mdr1的小鼠出現(xiàn)了骨髓增殖綜合癥的報(bào)道更令人擔(dān)憂。 近年多種化療藥物的耐藥基因被發(fā)現(xiàn),如:對(duì)環(huán)磷酰胺耐藥的醛脫氫酶基因、對(duì)烷化劑耐藥的六氧甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶基因、對(duì)5-FU耐藥的胸腺嘧啶合成酶基因、對(duì)氨甲喋呤耐藥的二氫葉酸還原酶

3、基因、對(duì)阿糖胞苷耐藥的胞苷脫氨基酶基因等。并得出如下結(jié)論:理想的耐藥基因應(yīng)具備多種藥物耐藥而非單一藥物、無免疫原性、治療基因片段較小、耐藥基因耐特異藥不宜毒性過大、基因轉(zhuǎn)染無突變及癌變產(chǎn)生。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),人突變的二氫葉酸還原酶基因(dihydrofolate reductase,DHFR)與胞苷脫氨基酶基因(cytidine deaminase,CD)具備上述條件。 為解決大劑量化療所引起的骨髓抑制問題,我們將DHFR與DHFR-

4、CD基因通過包裝細(xì)胞PA317導(dǎo)入小鼠骨髓細(xì)胞后,將轉(zhuǎn)染DHFR-CD基因的小鼠骨髓細(xì)胞移植給小鼠,觀察大劑量化療后的小鼠的血象、體重、生存率變化及小鼠骨髓細(xì)胞耐藥CFU-GM集落生成情況;同時(shí)檢測(cè)小鼠骨髓細(xì)胞耐藥基因的表達(dá)情況。進(jìn)而評(píng)估轉(zhuǎn)染了DHFR-CD基因的小鼠骨髓細(xì)胞對(duì)大劑量化療的耐受性,以了解所轉(zhuǎn)染基因在小鼠體內(nèi)的化療保護(hù)作用,為以后的雙耐藥基因臨床應(yīng)用提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P汀?方法: 一、質(zhì)粒擴(kuò)增感受態(tài)細(xì)胞置于離心

5、管中,分別加含質(zhì)粒DHFR、DHFR-CD及普通培養(yǎng)基,搖振后鋪于含抗生素的瓊脂平板表面,液體被吸收后倒置培養(yǎng),其菌落接種于培養(yǎng)液后培養(yǎng)過夜收集菌沉淀,質(zhì)粒提取、純化按試劑說明書進(jìn)行。 二、細(xì)胞的培養(yǎng)雙噬性包裝細(xì)胞PA317及小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3均于10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2的飽和濕度條件下維持細(xì)胞生長,PA317供轉(zhuǎn)染;NIH3T3細(xì)胞用作病毒上清滴度測(cè)定及輔助病毒的檢測(cè)。 三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

6、、克隆篩選及擴(kuò)增采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)將質(zhì)粒D}tFR及DHFR-CD分別轉(zhuǎn)染PA317細(xì)胞株后,用不同濃度的氨甲喋呤和阿糖胞苷進(jìn)行藥物篩選獲得耐藥克隆并擴(kuò)增耐藥細(xì)胞數(shù)量,另設(shè)不加質(zhì)粒的對(duì)照轉(zhuǎn)染組。 四、小鼠骨髓細(xì)胞的制備Balb/c小鼠尾靜脈注射5-Fu,3天后脫頸處死,酒精浸泡,取其股骨和脛骨,收集骨髓細(xì)胞制成懸液,淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞,懸于20%FCSRPMll640的塑料

7、培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)2h,回收懸浮的骨髓單個(gè)核細(xì)胞。 五、小鼠骨髓細(xì)胞的感染計(jì)數(shù)小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞總數(shù),使骨髓單個(gè)核細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因之病毒產(chǎn)生細(xì)胞按1:1的比例,置于含20%小牛血清和1%谷氨酰胺的10%WEHI條件培養(yǎng)液中,另設(shè)對(duì)照組用不加質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的PA317細(xì)胞。兩組在37℃、5%CO2條件下共培養(yǎng)48h后收集骨髓細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,置PBS平衡液中作CFU-GM培養(yǎng)及小鼠體內(nèi)移植用。 六、感染DHF

8、R和DHFR-CD后的小鼠骨髓細(xì)胞CFU-GM及耐藥基因的檢測(cè)檢測(cè)共培養(yǎng)后經(jīng)藥物處理的小鼠骨髓細(xì)胞的CFU-GM生成及前病毒基因整合及表達(dá)情況,培養(yǎng)分為兩組:實(shí)驗(yàn)組加入化療藥;對(duì)照組不加化療藥,培養(yǎng)第12d后計(jì)數(shù)集落,進(jìn)行結(jié)果分析。PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染DHFR小鼠骨髓細(xì)胞前病毒基因整合(proyiral integration);RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染DHFR-CD小鼠骨髓細(xì)胞基因表達(dá),提取其RNA、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA、PCR擴(kuò)增及電泳PCR產(chǎn)物

9、。 七、感染DHFR-CD后的小鼠骨髓細(xì)胞的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)Balb/c小鼠在致死量鈷60照射后根據(jù)體重隨機(jī)分為兩組:實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射感染后的小鼠骨髓細(xì)胞,對(duì)照組注射同等數(shù)量轉(zhuǎn)染對(duì)照組的小鼠骨髓細(xì)胞,細(xì)胞移植后4周,每只小鼠腹腔注射MTX和Ara-C,連續(xù)4d。觀察小鼠血象、體重及生存率的變化;5周后兩組各處死小鼠1只,取其骨髓細(xì)胞做CFU-GM培養(yǎng)及耐藥基因檢測(cè)。 結(jié)果: 一、穩(wěn)定的產(chǎn)病毒細(xì)胞擴(kuò)增、純化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染P

10、A317細(xì)胞、經(jīng)藥物篩選后見耐藥克隆生長,擴(kuò)大培養(yǎng)其耐藥基因檢測(cè)陽性;以NIH3T3為靶細(xì)胞測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度,當(dāng)病毒原液為0.01 ml時(shí),DHFR和DHFR-CD病毒滴度分別為3.21×104CFU/mL、3.35×104CFU/mL;病毒原液為0.10ml時(shí),DHFR和DHFR-CD病毒滴度分別為1.43×105CFU/L、1.54×105CFU/L;輔助病毒的檢測(cè)無復(fù)制活性病毒產(chǎn)生。表明制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒或轉(zhuǎn)染的PA317可供感染

11、細(xì)胞用。 二、轉(zhuǎn)染DHFR小鼠骨髓細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn): 1、小鼠骨髓細(xì)胞耐藥克隆形成實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組均不加MTX時(shí)其耐藥克隆數(shù)分別為287和273,加入時(shí)其耐藥克隆數(shù)分別為42(14.6%)和0,兩組克隆出現(xiàn)率比較具有顯著性差異(P<0.05),說明轉(zhuǎn)染DHFR的小鼠骨髓細(xì)胞對(duì)MTX有明顯的耐受性。 2、實(shí)驗(yàn)組PCR產(chǎn)物電泳顯示轉(zhuǎn)染基因條帶而對(duì)照組未顯示,說明小鼠骨髓細(xì)胞已成功轉(zhuǎn)染DHFR基因。 三、轉(zhuǎn)染

12、DHFR-CD小鼠骨髓細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn): 1、小鼠骨髓細(xì)胞耐藥克隆形成實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組均不加入MTX和Ara-C,其耐藥克隆數(shù)分別為307和296,加入兩藥其耐藥克隆數(shù)分別為47(15.3%)和0,兩組克隆出現(xiàn)率比較具有顯著性差異(P<0.05),說明轉(zhuǎn)染雙耐藥基因的小鼠骨髓細(xì)胞對(duì)MTX和Ara-C有明顯的耐受性。 2、實(shí)驗(yàn)組RT-PCR產(chǎn)物電泳顯示轉(zhuǎn)染基因條帶而對(duì)照組未顯示,說明轉(zhuǎn)染的DHFR-CD在分子生物學(xué)上有表

13、達(dá)。 四、轉(zhuǎn)染DHFR-CD小鼠骨髓細(xì)胞的體內(nèi)實(shí)驗(yàn): 1、轉(zhuǎn)雙耐藥基因小鼠在大劑量MTX和Ara-C注射后,小鼠體重、白細(xì)胞開始下降,但較對(duì)照組下降幅度小,至第6周其白細(xì)胞恢復(fù)正常;其存活率為66.7%而對(duì)照組為0,兩組比較具有顯著性差異(P<0.01)。 2、小鼠骨髓細(xì)胞耐藥克隆形成實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組不加入MTX和Ara-C,兩組耐藥克隆數(shù)分別為167和173,兩組加入兩藥其耐藥克隆數(shù)分別為42(25.1%)

14、和0,兩組比較具有顯著性差異(P<0.05),說明轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)兩種藥物有一定程度的抗藥性。 3、轉(zhuǎn)基因組小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)RT-PCR檢測(cè),顯示有耐藥基因條帶而對(duì)照組未顯示,說明經(jīng)轉(zhuǎn)染的耐藥基因在小鼠體內(nèi)有表達(dá)。 結(jié)論: 1、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將質(zhì)粒DHFR及DHFR-CD轉(zhuǎn)染入PA317細(xì)胞株,可以獲得安全穩(wěn)定的產(chǎn)病毒的細(xì)胞系。 2、小鼠骨髓細(xì)胞與產(chǎn)病毒的細(xì)胞共培養(yǎng)可以將耐藥基因轉(zhuǎn)染到小鼠骨髓細(xì)胞,且能夠有

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