集胞藻轉(zhuǎn)抗菌肽基因及硝酸還原酶缺失突變載體構(gòu)建的研究.pdf

1、藍(lán)藻又稱為藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)，是一類光合自養(yǎng)型的原核生物，因其獨(dú)特的性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究。近年來，隨著對藍(lán)藻分子遺傳學(xué)的深入研究，通過重組DNA技術(shù)人工構(gòu)建藻類新株系，以及生產(chǎn)藍(lán)藻基因工程產(chǎn)物，成為藍(lán)藻基因工程的兩大目標(biāo)，并取得了重大突破。 抗菌肽CM4是從中國家蠶蛹中分離到的具有最強(qiáng)生物活性的組分，由35個氨基酸組成。它具有廣譜的抗細(xì)菌、真菌、病毒、原生動物和某些腫瘤的活性，并對水產(chǎn)致病菌也有

2、較強(qiáng)的抑殺作用。但是天然的抗菌肽制備量少，純度不夠高。通過基因工程的方法，將抗菌肽CM4在集胞藻中進(jìn)行表達(dá)，用作水產(chǎn)餌料，起到“食-藥”合一的目的。這為解決防治水產(chǎn)品疾病和減少抗生素使用的矛盾提供了一條有效的途徑，可獲得巨大的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境生態(tài)效益。 本研究是利用集胞藻作為受體，構(gòu)建了包含表達(dá)單元pCΩ“啟動子-抗菌肽CM4基因-終止單元”的整合載體pBS-S1-pCΩ，采用自然轉(zhuǎn)化將目的基因轉(zhuǎn)入集胞藻，獲得了具有抗性的轉(zhuǎn)基因藻

3、。對得到的轉(zhuǎn)基因藻進(jìn)行的活性抑菌分析和PCR檢測結(jié)果表明，pBS-S1-pCΩA株系已經(jīng)能夠成功表達(dá)出有活性的抗菌肽，是陽性轉(zhuǎn)基因藻。 對轉(zhuǎn)基因藻的生長情況測定表明，在常規(guī)培養(yǎng)條件下，pBS-S1-pCΩA藻株與野生藻的細(xì)胞密度和葉綠素含量類似。光合放氧測定的結(jié)果顯示，pBS-S1-pCΩA藻株的光合放氧活性與野生藻相比，pBS-S1-pCΩA藻株提高了1 9.86％。說明基因修飾后轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因藻有著良好的光能利用效率。

4、 在轉(zhuǎn)基因藻研究中，特別是利用藻作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源基因時，從大量未轉(zhuǎn)化細(xì)胞背景中篩選并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子，必須依賴于有效的選擇標(biāo)記。目前，有關(guān)集胞藻選擇標(biāo)記的研究較少，主要有除草劑、抗生素抗性因子等研究。 集胞藻中的硝酸鹽還原酶(nirtaterumdcaste，NR)作為限速酶，催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，這一過程在氮代謝中處于關(guān)鍵地位，對藻的生長發(fā)育、產(chǎn)量形成有重要影響。因此在轉(zhuǎn)基因集胞藻的研究中，硝酸還原酶基因是更加安全