全新抗菌肽基因的功能及相關(guān)研究.pdf

1、根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室首先克隆的mL52基因序列設(shè)計(jì)引物，以人胎肝cDNA文庫(kù)為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了人類同源新基因，因其富含甘氨酸而命名為一hGlyrichin。在生物信息學(xué)分析提示其為抗菌肽和初步證實(shí)該基因具有抗菌作用的基礎(chǔ)上，為了尋找該蛋白序列的核心功能區(qū)段，進(jìn)一步借助生物信息學(xué)分析結(jié)果，分段合成了系列肽段并對(duì)這些肽段的抗菌活性進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果證實(shí)，從第42到60位氨基酸的19個(gè)氨基酸(pCM-19)為該蛋白的核心功能區(qū)。為此，對(duì)pCM

2、-19的抗菌活性、抗菌作用機(jī)理及抗菌肽的普遍副作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，pCM-19不僅具有抗實(shí)驗(yàn)室工程菌的活性，而且具有抗鼠疫桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌和腦膜炎球菌的作用。更可喜的是該肽段具有抗攜帶氨芐青霉素抗性基因的實(shí)驗(yàn)室工程菌和抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的活性，提示pCM．19具有廣譜抗菌作用并為該抗菌肽的應(yīng)用提供了有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。pCM-19抗菌活性的穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，該肽段經(jīng)100~C加熱30rain和60min及反

3、復(fù)凍融3次，其抗菌活性完全不受影響；溶液狀態(tài)在4~C放置80天，抗菌活性仍可保留98％以上；經(jīng)胰蛋白酶處理60min后，抗菌活性保留30％。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pCM一19具有良好的穩(wěn)定性，也為其發(fā)展成藥提供了重要實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 為了研究該肽段的抗菌作用機(jī)理，采用流式熒光激活細(xì)胞分析(FACScan)和掃描電子顯微鏡分析了pCM-19對(duì)靶細(xì)菌膜完整性的影響。兩種方法所得結(jié)果一致提示，pCM-19可能作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁和／或細(xì)胞膜，通過(guò)

4、破壞膜的完整性并進(jìn)而導(dǎo)致靶細(xì)菌胞質(zhì)內(nèi)容物外泄而發(fā)揮殺菌作用。這與目前已知陽(yáng)離子抗菌肽的主要作用機(jī)制類似。 抗菌肽的溶血作用是抗菌肽常見(jiàn)的副作用，也是某些抗菌肽發(fā)展成藥的主要障礙。為此，本文對(duì)pCM-19的溶血作用進(jìn)行了體內(nèi)、外測(cè)試，結(jié)果證實(shí)，pCM．19在體外無(wú)溶解人紅細(xì)胞的作用，在體內(nèi)無(wú)溶解鼠紅細(xì)胞的作用。 上述研究表明：pCM一19有確定的廣譜抗菌作用；理化性質(zhì)穩(wěn)定；抗菌作用主要通過(guò)破壞靶細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性實(shí)現(xiàn)；體內(nèi)