團頭魴三個抗菌肽基因的鑒定與表達研究.pdf

1、NK-LYSIN是機體自然殺傷細胞(natural killer cells，NKL)和毒性T細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)分泌的小分子陽離子抗菌肽，同人類顆粒溶素granulysin是同源多肽，具有廣譜的抗菌活性，對細菌、真菌、病毒、癌細胞等均有生物活性。組蛋白H2A是真核生物體細胞染色質(zhì)中的一種結(jié)構(gòu)蛋白，是先天性免疫的組成成分之一，其衍生的多肽片段的殺菌作用已成為目前的研究熱點。
　　團頭魴（M

2、egalobrama amblycephala）是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，集約化程度的提高以及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，導(dǎo)致各類疾病頻發(fā)。其中，對團頭魴養(yǎng)殖影響最大的疾病是由嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）感染引起的細菌性敗血癥，可造成魚體各部位充血、潰瘍、腹腔積水和肝臟發(fā)白等癥狀，從而導(dǎo)致魚體大量死亡。另外，現(xiàn)階段還沒有很好的藥物可以控制，養(yǎng)殖業(yè)中則主要使用抗生素提高魚體免疫力，但抗生素會造成藥物殘留

3、和細菌耐藥性，嚴重影響水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和人類健康，新型抗菌藥物的研發(fā)成為熱點。
　　本研究從團頭魴轉(zhuǎn)錄組中釣取到2個NK-lysin基因（nkla和nklb）和1個H2A基因，通過PCR擴增和測序驗證其ORF序列，并分析序列特征。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測其在團頭魴胚胎發(fā)育不同時期以及成魚組織和嗜水氣單胞菌感染后免疫組織中的表達。構(gòu)建團頭魴2個NK-lysin基因的原核表達載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進行重組表達，并對其表達條件進行優(yōu)化，為進

4、一步研究NK-lysin的功能奠定了基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.團頭魴3個抗菌肽基因(nkla、nklb和H2A)的序列分析
　　nkla ORF全長369bp，編碼122個氨基酸，DNAstar預(yù)測其等電點為6.71，分子質(zhì)量為14kDa; nklb ORF全長411bp，編碼136個氨基酸，DNAstar預(yù)測其等電點為6.72，分子質(zhì)量為15.6kDa。多氨基酸序列比對分析顯示，nkla和nklb的N端均含有信

5、號肽，6個高度保守半胱氨酸，可形成3對分子內(nèi)二硫鍵，以及1個SapB結(jié)構(gòu)域，序列分析發(fā)現(xiàn)它屬于鞘脂激活蛋白樣蛋白家族成員。系統(tǒng)進化分析顯示，團頭魴NK-lysin基因與斑馬魚親緣關(guān)系最近，其次是半滑舌鰨和斑點叉尾鮰。組蛋白H2A基因ORF全長387bp，編碼128個氨基酸，DNAstar預(yù)測其等電點為10.92，分子質(zhì)量為16.2kDa。H2A氨基酸序列不含跨膜結(jié)構(gòu)域及信號肽，且其序列十分保守，不同物種間序列相似性極高。
　　2.

6、團頭魴3個抗菌肽基因在不同發(fā)育時期及成魚各組織中的表達
　　熒光定量PCR結(jié)果顯示，nkla和nklb在胚胎發(fā)育的不同時期廣泛表達。在胚胎發(fā)育的初始階段，nkla和nklb呈低表達，而在出膜期時，nkla和nklb表達量快速上升。其中，nkla在眼球色素出現(xiàn)期達到最高表達，nklb在出膜后1d時達到最高值。H2A也在胚胎發(fā)育期廣泛表達，且在出膜后7d達到最高值。
　　在健康團頭魴各組織中，nkla在脾臟中表達量極高，為其他組

7、織中的數(shù)百倍，而在肌肉、血中表達量極低，在肝臟、腦、腎臟、頭腎、腸、鰓和心中均有明顯表達;nklb則在腸中表達量相對較高，在脾臟、頭腎表達相對較低，在其他組織中均表達。nkla和nklb不同的表達模式暗示著不同的NK-lysin可能存在功能上的分化。H2A在血中表達量最高，腦中其次，其他組織中表達量相對較低。
　　3.團頭魴3個抗菌肽基因在嗜水氣單胞菌感染后的表達
　　嗜水氣單胞菌感染后，團頭魴nkla和nklb兩個基因在不

8、同組織中的表達變化模式相似:在頭腎中，nkla在感染后表達顯著性下降，nklb則在4h、24h及120h時呈顯著下降水平;在肝臟中，均在4h時上升到最高水平，而后回落;在脾臟中，則在72h升到最高水平，120h恢復(fù)正常;在腸中，nkla和nklb表達量在4h時顯著降低，并分別在72h和24h時達到最高值，120h回到正常水平。nkla和nklb在主要免疫組織中的表達變化，暗示著它們可能在團頭魴抵抗嗜水氣單胞菌侵染過程中發(fā)揮重要作用。H2

9、A基因在肝臟和腸中的表達量均呈上升趨勢，在脾臟和腎臟中，H2A的表達則是先呈下降趨勢，而后顯著上升。
　　4.團頭魴nkla和nklb的原核表達
　　成功構(gòu)建了3種nkla和nklb的原核表達載體，轉(zhuǎn)入到BL21(DE3)宿主菌中，獲得原核表達菌株，對IPTG濃度、溫度和誘導(dǎo)時間等各條件進行優(yōu)化。在pET32a-NKLA和pET32a-NKLB重組表達體系中，融合蛋白NKLA只在沉淀中表達，NKLB則在上清和沉淀中表達，但該

10、表達體系不穩(wěn)定。而對于pET28a-NKLA和pET28a-NKLB表達體系，NKLA沒有表達，NKLB在沉淀中只有少量表達。在pGEX-NKLA和pGEX-NKLB表達體系中，融合蛋白主要以包涵體形式存在，分子量分別為38.2kDa和39.7kDa，且該表達體系較穩(wěn)定。選擇誘導(dǎo)時間為8h，在不同IPTG終濃度和各溫度條件下，融合蛋白表達量沒有明顯差異，其中融合蛋白NKLA在37℃下IPTG濃度為0.05mmol/L時，目的蛋白占菌體總