親和毛細管電泳法測定二氫葉酸還原酶的活性及與氨甲蝶呤對映體反應動力學參數(shù).pdf

1、親和毛細管電泳(ACE)是高效毛細管電泳(HPCE)技術(shù)的一種分離模式，結(jié)合了物質(zhì)之間的親和作用和毛細管電泳分離的原理，主要是指在電泳過程中具有生物專一性親和力的兩種分子受體(receptor)和其配體(Iigand)間，發(fā)生了特異性相互作用，形成了受體一配體復合物，通過研究受體或配體在發(fā)生親和作用前后的電泳譜圖變化，可獲得有關受體-配體親和力大小、結(jié)構(gòu)變化、作用產(chǎn)物等方面的信息。目前ACE技術(shù)廣泛應用于分子生物學和生物化學等研究領域，

2、如核酸片段的特異性識別、蛋白相互作用、競爭性免疫分析、藥物一受體和藥物一蛋白作用研究等。通過改善被分析物的電泳遷移行為，可提高分析靈敏度、選擇性和分辨率。 二氫葉酸還原酶(DHtFR)和氨甲蝶呤(MTX)手性對映體是本課題的主要研究對象。本論文首次用親和毛細管電泳法測定DHFR活性及與MTX對映體反應動力學參數(shù)，觀察MTX對映體對DHFR是否有立體選擇性，為臨床使用對映體藥物時要考慮其在代謝過程中對關鍵酶的立體選擇性提供線索。

3、 第一部分親和毛細管電泳法測定二氫葉酸還原酶的活力 二氫葉酸還原酶(DHFR)在還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的參與下，催化7，β-二氫葉酸(FH2)還原成5，6，7，8-四氫葉酸(FH4)，同時NADPH轉(zhuǎn)化為NADP+。由于FH4作為一碳單位的載體，參與體內(nèi)DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的生物合成，因而該酶對于生物體的新陳代謝有重要的作用。DHFR不僅與腫瘤細胞的繁殖和復制密切相關，而且在臨床在使用化療藥物時DHFR發(fā)生變化是導

4、致腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥的重要機理之一，所以研究DHFR的活性具有重要的現(xiàn)實意義。 本研究采用親和毛細管電泳技術(shù)測定DHFR反應動力學常數(shù)，選用DHFR、FH2、NADPH作為反應體系，通過調(diào)節(jié)電泳緩沖液的種類、離子強度、pH值、添加的表面活性劑的濃度、運行電壓及毛細管的溫度，優(yōu)化出實現(xiàn)酶反應體系中各組分離的最適條件為含0.2％Brij-35的pH9.50的50 mmol/L硼砂緩沖溶液，分離電壓25kV，分離溫度25℃，進樣壓力0.

5、5psi，進樣時間10s，檢測波長254nm，電流為174.3μA。結(jié)果表明親和毛細管電泳可以在30min內(nèi)實現(xiàn)DHFR反應體系中反應物和生成物的分離，觀察不同底物濃度下的電泳圖譜，利用反應物或者生成物峰面積的變化來研究在酶反應過程中反應物或者生成物濃度的變化，計算出二氫葉酸還原酶的Km值為6.05×10-7mol/L.min，與其它文獻報道一致。親和毛細管電泳方法具有進樣量少、操作簡便、靈敏皮高、易于分離和定量、檢測速度快等優(yōu)點，已被

6、廣泛地應用于生物體內(nèi)酶活性的研究。 第二部分親和毛細管電泳法測定氨甲蝶呤對映體與二氫葉酸還原酶反應動力學參數(shù) 氨甲蝶呤(MTX)是DHFR的強抑制劑，能與DHFR的活性部位發(fā)生可逆而牢固地結(jié)合，使該酶失活，它比葉酸對此酶的親和力大105倍，因此MTX的抗腫瘤作用強而持久，是常見的腫瘤化療藥物之一。自然界中的MTX為手性對映體，存在L和D兩種構(gòu)型，分別為L-(+)-MTX和D-(-)-MTX，但這兩種對映體藥物的活性是否存

7、在差異，國內(nèi)外均未見相關報道。 本研究亦采用親和毛細管電泳技術(shù)，反應體系選用DHFR、FH2、NADPH的混合物，毛細管優(yōu)化的分離條件同第一部分。將已知的L-(+)-MTx和D-(-)-MTX分別作用于所建立的DHFR體系，根據(jù)酶反應生成物峰面積的變化測定兩種對映體的半數(shù)抑制濃度。觀察不同濃度的氨甲蝶呤對映體L-(+)-MTx和D-(-)-MTX對DHFR抑制的電泳圖譜，根據(jù)反應生成物NADP+峰面積的變化計算得出D-(-)-M

8、TX的IC50為31.67×10-mol/L,L-(+)-MTX的IC50為2.48×10-8mol/L，兩者相差13倍左右，結(jié)果表明MTX兩種對映體對DHFR抑制差異存在統(tǒng)計學意義，本方法用于MTX對映體與DHFR反應動力學參數(shù)的測定，每次反應總體積僅為100μl，2ml的分離試劑，且在30min內(nèi)能準確分離并定量反應物和生成物，與其它傳統(tǒng)的方法以及高效液相色譜法相比，具有明顯的優(yōu)勢。 第三部分人非小細胞肺癌A549細胞中二氫

9、葉酸還原酶的提取純化 用體外培養(yǎng)的人非小細胞肺癌A549細胞為實驗對象，離心收集對數(shù)生長期的腫瘤細胞，超聲破碎細胞離心提取上清液，上樣于蛋白純化儀，運用的是1.3cm×10cm DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，從肺癌A549細胞中提取純化得到DHFR。通過調(diào)節(jié)超聲破碎的功率、間隔時間、次數(shù)以及離子交換層析柱平衡緩沖液的pH、KC1洗脫濃度梯度、洗脫的速度，得出純化DHFR的最佳條件，收集洗脫的蛋白

10、峰，進行12％SDS-PAGL垂直板電泳分析，根據(jù)標準分子量蛋白來統(tǒng)計條帶的分子量。將含DHFR酶各管溶液冷凍真空干燥，-60℃儲存?zhèn)溆?。DEAE-Sepharose Fast Flow利用離子交換和分子篩的原理，根據(jù)酶的等電點調(diào)節(jié)平衡緩沖液的pH值，以及控制流速充分利用其分離能力，可以用于細胞中DHFR的提取純化。 總結(jié)： 總之，親和毛細管電泳技術(shù)可以用于DHFR活性以及與MTX對映體反應動力學參數(shù)的測定，首次檢測出M