毛細管電泳免疫-激光誘導(dǎo)熒光檢測技術(shù)測定氨甲蝶呤對映體耐藥A549細胞株中葉酰聚谷氨酸合成酶.pdf

1、背景：氨甲蝶呤(Methotrexate,MTX)是許多葉酸途徑抗腫瘤藥物的前體，存在L-(+)-MTX和D-(-)-MTX 2種形式的對映體，廣泛應(yīng)用于淋巴瘤、急性白血病和肺癌等多種腫瘤的治療，作為MTX代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一的細胞內(nèi)葉酰聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase，F(xiàn)PGS)，其含量和活性直接與MTX作用效果相關(guān)，已成為當(dāng)今研究的熱點，但有關(guān)FPGS定量檢測的報道甚少。 目的：

2、建立一種FPGS定量檢測方法，優(yōu)化該方法實驗條件，對該方法的特異性，分離度及靈敏度等進行方法學(xué)評價，并對其檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析。用該方法檢測不同氨甲蝶呤(MTX)對映體作用肺癌A549細胞株前后細胞株內(nèi)FPGS表達含量，觀察FPGS含量變化，為深入探討腫瘤耐藥機制提供新的研究平臺?！　》椒ǎ菏紫壤么髣┝繚舛冗f增沖擊法誘導(dǎo)耐藥的方法分別誘導(dǎo)建立25μmol/LL-(+)-MTX耐藥細胞株和25 μmol/LD-(-)-MTX耐藥細胞株

3、，以敏感細胞株作為細胞內(nèi)FPGS表達含量的對照；對濕重均約為100mg的敏感細胞株、25μmol/L/LL-(+)-MTX耐藥細胞株和25μmol/L D-(-)-MTX耐藥細胞株的三組細胞株采用液氮中反復(fù)凍融的方法，完全破壞細胞，獲取細胞蛋白上清提取液；提取液經(jīng)經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡(Western blot)分析；細胞提取液在室溫暗室里與經(jīng)過透析標(biāo)記法，采用異硫氰酸熒光素(fluorescein i

4、sothiocynate，F(xiàn)ITC)衍生標(biāo)記的FPGS抗體反應(yīng)30 min，使標(biāo)記抗體與FPGS發(fā)生特異性非競爭性免疫反應(yīng)；反應(yīng)后立即采取毛細管膠束電動色譜(micellar electrokinetie capillary chromatography,MECC)法結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光(1aser-induced fluorescence，LIF)檢測技術(shù)的毛細管電泳免疫.激光誘導(dǎo)熒光檢測技術(shù)(immunity analysis 0f c

5、apillaryelectrophoresis-1aser-induced fluorescence，CEIA-LIF)分離檢測FITC衍生標(biāo)記FPGS以及FPGS抗原抗體復(fù)合物，檢測MTX不同對映體作用肺癌A549細胞株中FPGS表達含量的。 結(jié)果：經(jīng)SDS-PAGE確認FPGS分子量約為66 000D，WB實驗確認FPGS與其特異性抗體沒有其他條帶出現(xiàn)，并通過凝膠成像系統(tǒng)初步定量：25μmol/L L-(+)-MTX和25

6、μmol/L D-(-)-MTX誘導(dǎo)耐藥細中FpFPGS的表達含量分別為敏感細胞的52.14％和60.06％；CEIA-LIF檢測方法分離標(biāo)記FPGS抗體與免疫復(fù)合物的時間分別為7.1min、8.9min，且在10min內(nèi)即完成蛋白的分離和檢測，分離度R=4。5；CEIA.LIF檢測FPGS的方法在敏感細胞株內(nèi)檢出限為0.6788mg/μl細胞；運用CEIA-LIF檢測細胞內(nèi)FPGS的表達含量的方法，計算得出25μmol/L L-(+)

7、-MTX和25 μmol/L D-(-)-MTX誘導(dǎo)耐藥細胞中FPGS的表達含量分別為敏感細胞的46.59％和48.36％，該結(jié)果和經(jīng)典的WB初步定量結(jié)果，經(jīng)SPSS 13.0 Wald模式處理軟件分析得知P>0.05，說明兩者沒有顯著差異。 結(jié)論：CEIA-LIF檢測FPGS方法具有檢測速度快，測定時間短的特點。且通過經(jīng)典的WB法做對照，該方法具有高度的特異性和FPGS定量的準(zhǔn)確性。通過該方法中運用了FITC標(biāo)記技術(shù)、MEC