毛細管電泳激光誘導熒光檢測方法及應用研究.pdf

1、毛細管電泳(CE)是高效、快速、樣品和試劑消耗少的一種分離技術，存在的主要缺點之一就是檢測靈敏度低，提高檢測靈敏度是目前CE研究的熱點之一。激光誘導熒光(LIF)檢測是CE最靈敏的檢測方法之一，不僅可以提高檢測靈敏度，還可改善選擇性，極大地拓展了CE的應用，特別在生物樣品方面具有廣闊的應用前景。柱前衍生檢測需要額外的操作步驟，并且要求衍生產(chǎn)物具有一定的穩(wěn)定性，對具有多重標記位點的分析物會出現(xiàn)多重峰。對此，柱后衍生LIF檢測此時是更好的選

2、擇，而且特別適合于高速在線衍生檢測。另一方面，CE的檢測靈敏度受限于毛細管較短的檢測光程，而且毛細管管壁也容易產(chǎn)生散射光，增加背景噪音。無窗檢測池可以增加檢測光程降低背景噪音，提高信噪比。 本論文綜述了CE靈敏的檢測方法和技術，CE-LIF檢測原理、儀器結構，熒光衍生方法和柱后衍生反應器。本論文的主要研究內(nèi)容包括組裝了簡便的CE-LIF檢測系統(tǒng)，發(fā)展了一種簡單易于制作的CE-LIF柱后反應器，并應用于牛奶和動物樣品中卡那霉素類抗

3、生素殘留的分析檢測，另外還提出CE無窗式檢測的新方法。論文的主要內(nèi)容和研究成果具體如下： 1、組裝了一臺毛細管電泳激光誘導熒光檢測系統(tǒng)。采用共線型光學結構組裝激光誘導熒光檢測系統(tǒng)，利用核黃素作為分析樣品，對影響系統(tǒng)檢測性能的光學器件如光闌孔徑、光電倍增管的工作電壓條件進行了優(yōu)化，并討論了進一步提高檢測靈敏度的措施。核黃素的濃度檢出限達到9.0×10<'-9>mol/L(3.4×10<'-6>g/L)，質(zhì)量檢出限為18 amol，

4、在3.0×10<'-8>～1.0×10<'-5>mol/L濃度范圍內(nèi)成呈良好的線性關系，方法的相對標準偏差(RSD)為2.4％。 2、研制了一種毛細管電泳激光誘導熒光檢測的共軸-間隙柱后反應器。采用毛細管聚酰亞胺涂層套對接和準直分離和反應毛細管，衍生試劑從涂層套和分離毛細管之間的環(huán)隙，以及兩根毛細管之間的間隙引入反應管中，實現(xiàn)高效分離和快速衍生反應。設計了衍生反應池的加壓及沖洗裝置，從而解決了柱后衍生反應通道堵塞的問題。氨基酸的

5、檢出限為8×10<'-8>～1.0×10<'-6>mol/L，在兩個多數(shù)量級濃度范圍內(nèi)呈線性關系，其中甘氨酸線性范圍為5×10<'-7>～1×10<'-4> mol/L，分離效率1.35×10<'5>～1.67×10<'5>理論塔板數(shù)，并成功地應用于香醋樣品中的游離氨基酸的測定。該反應器結構簡單，易于制作，無需顯微操作，可以采用短的反應距離適用于快速和產(chǎn)物易分解的衍生反應。在毛細管電泳分析中，毛細管的準直耦合以及在柱試劑引入方面將會具有

6、廣泛的應用前景。 3、提出毛細管電泳柱后衍生激光誘導熒光測定卡那霉素類抗生素方法。利用共軸-間隙柱后反應器，以酸性乙酸鈉鹽緩沖液，在反向電滲流和負高壓下分離卡那霉素類抗生素，再與堿性硼酸鈉鹽緩沖液中的衍生試劑柱后衍生反應，用激光誘導熒光檢測。該柱后反應衍生方法避免了分離緩沖液和衍生緩沖液兩種不同緩沖體系的相互干擾，提高了分離度和檢測靈敏度。氨基糖苷的檢出限為3.6×10<'-5>～5.2×10<'-5>g/L，線性范圍為1.1×

7、10<'-4>～5.0×10<'-2>g/L。該法用于牛奶和動物組織中的卡那霉素類抗生素殘留的測定，回收率為81.6％～95.3％(n=4)。 4、提出一種毛細管電泳激光誘導熒光無窗式檢測方法。利用聚酰亞胺涂層套準直兩段毛細管制作了無窗檢測池，利用顯微成像監(jiān)測檢測池間隙距離和電泳分離電壓對無窗檢測池外形的影響，考察了分離電壓對熒光檢測信號的影響，理論分析和實驗驗證了無窗檢測的可行性。在優(yōu)化的實驗條件下，比較了無窗式檢測和在柱檢測的性能，

8、結果表明采用無窗檢測池，熒光信號增強，背景噪音減小，檢出限降低，其中核黃素的檢測靈敏度甚至提高了15倍。線性范圍達到兩個數(shù)量級以上，其中RF的線性范圍為5.0×10<'-9>～1.0×10<'-6> mol/L，無窗檢測分離效率為1.0×10<'5>～2.4×10<'5>理論塔板數(shù)，RSD(n=5)在3.7％～5.8％范圍。用無窗式檢測方法成功測定了實際樣品菠菜和萵苣葉中三種黃素類化合物的含量。鑒于無窗檢測池易于制作，沒有在柱檢測管壁出