苦參堿對(duì)大鼠肝癌前病變的阻斷作用及對(duì)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控作用.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界每年新發(fā)病例數(shù)超過(guò)50萬(wàn)，其中我國(guó)占20％，其死亡率在我國(guó)惡性腫瘤中居第二位。HCC的發(fā)生是多基因突變、多因素、多途徑的過(guò)程。其中信號(hào)傳導(dǎo)在腫瘤形成過(guò)程中的作用正在逐步被闡明，信號(hào)傳導(dǎo)通路已成為抗腫瘤藥物研究的新靶點(diǎn)。近年來(lái),肝癌前病變期的特殊病理改變逐漸引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的注意，發(fā)現(xiàn)此階段雖然細(xì)胞形態(tài)尚未發(fā)生明顯改變，但已出現(xiàn)一些酶學(xué)及蛋白表達(dá)異常，這些細(xì)胞在某些

2、因素持續(xù)作用下可發(fā)生癌變，故深入研究此階段的病理機(jī)制，為早期干預(yù)逆轉(zhuǎn)這種初始病變、阻斷肝癌形成提供了理論依據(jù)。本研究應(yīng)用酶組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)等技術(shù)研究了大鼠肝癌前病變的病理改變及Wnt信號(hào)通路的變化，同時(shí)應(yīng)用血清藥理學(xué)方法，探討了苦參堿誘導(dǎo)大鼠肝卵圓細(xì)胞WB-F 344細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞定向分化的作用，推測(cè)此作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。 第一部分苦參堿對(duì)大鼠肝癌前病變的阻斷作用及對(duì)Wnt信號(hào)通路的影響

3、 目的：觀察大鼠肝癌前病變的形態(tài)學(xué)、酶學(xué)、蛋白表達(dá)的改變，了解肝癌前病變期的基本病理改變以及苦參堿阻斷肝癌前病變過(guò)程中Wnt信號(hào)通路的作用。 方法： 1.肝癌前病變模型的建立：60只大鼠隨機(jī)分為3組：A：模型組；B：苦參堿組；C：正常對(duì)照組。A、B組采用腹腔注射二乙基亞硝胺(DEN)+含0.015％二乙酰氨基芴(2-AAF)飼料飼養(yǎng)+2/3肝切除方法復(fù)制大鼠肝癌前病變模型，B組給予苦參堿灌胃，7周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

4、 2.應(yīng)用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)改變；酶組織化學(xué)觀察各組肝組織γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GTase)、三磷酸腺苷酶(ATPase)分布及定量比較；免疫組織化學(xué)觀察各組Thy-1(CD90)、白蛋白(ALB)、甲胎球蛋白(AFP)、Wnt-1蛋白，軸蛋白(Axin)，β鏈蛋白(β-catenin)分布及定量比較。 結(jié)果： 1.肝臟癌前病變模型組織HE染色：7周末A組模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)消失，匯

5、管區(qū)小膽管增生，沿小膽管外側(cè)可見(jiàn)卵圓細(xì)胞大量增生，有的卵圓細(xì)胞以匯管區(qū)為中心向肝實(shí)質(zhì)內(nèi)爬伸樣生長(zhǎng)，破壞鄰近肝板；B組肝小葉結(jié)構(gòu)存在，可見(jiàn)少量變異肝細(xì)胞，卵圓細(xì)胞增生較少。 2.酶組化染色：γ-GTase:A組可見(jiàn)多處位于匯管區(qū)周圍或肝小葉內(nèi)鮮艷的橢圓形玫瑰紅色陽(yáng)性反應(yīng)灶。B組病灶著色明顯較淡，病灶范圍小，A、B組單位面積內(nèi)病灶面積為(mm2/cm2)：8.24±0.53、3.25±0.47，B組有顯著抑制γ-GT酶變?cè)畹淖饔?P

6、<0.01)。ATPase：A組均可見(jiàn)到位于肝小葉內(nèi)的橢圓形陰性反應(yīng)灶，B組病灶范圍均縮小。 3.免疫組化染色：C組中Thy-1、AFP蛋白表達(dá)陰性，A組AFP蛋白在匯管區(qū)或肝小葉內(nèi)高表達(dá)，B組表達(dá)下調(diào)；ALB在C組肝組織中彌漫性均勻表達(dá)，在A組中表達(dá)明顯減少，B組表達(dá)上調(diào)，B組、C組與A組比較有顯著差異。Wnt-1、β-catenin在C組中肝組織細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)均勻一致少量表達(dá)，A組可見(jiàn)匯管區(qū)周邊及肝小葉內(nèi)增生灶中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，

7、經(jīng)B組苦參堿干預(yù)后陽(yáng)性區(qū)域的面積及著色深度均有不同程度減少；Axin在C組中肝細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)，部分細(xì)胞核表達(dá)，A組表達(dá)減弱，病灶區(qū)表達(dá)陰性，B組苦參堿干預(yù)后陽(yáng)性區(qū)域的面積及著色深度均有不同程度增高；B組、C組與A組比較有顯著差異。 結(jié)論： 1.大鼠肝癌前病變階段以卵圓細(xì)胞大量增生為特征性改變，病灶內(nèi)γ-GTase、ATPase、Thy-1、AFP表達(dá)較強(qiáng)，苦參堿可減輕上述病變，誘導(dǎo)ALB表達(dá)。 2.苦參

8、堿具有誘導(dǎo)肝癌前病變中卵圓細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞發(fā)育分化的作用，而此作用與下調(diào)Wnt信號(hào)通路的活性有關(guān)。 第二部分　苦參堿對(duì)大鼠肝卵賀細(xì)胞WB－F344細(xì)胞增殖及對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)控作用 目的：了解體外培養(yǎng)的大鼠肝卵圓細(xì)胞株WB-F 344細(xì)胞中Wnt信號(hào)的表達(dá)情況及苦參堿對(duì)WB-F 344細(xì)胞表達(dá)Wnt信號(hào)分子的調(diào)節(jié)作用，探討苦參堿對(duì)該細(xì)胞分化的影響。 方法： 1.肝卵圓細(xì)胞的培養(yǎng)與藥物干預(yù)：無(wú)菌培養(yǎng)WB-

9、F 344細(xì)胞，應(yīng)用MTT法檢測(cè)苦參堿對(duì)WB-F 344細(xì)胞株增殖影響，并應(yīng)用經(jīng)典誘導(dǎo)劑丁酸鈉作為對(duì)照。 2.免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)苦參堿、丁酸鈉對(duì)WB-F 344細(xì)胞表達(dá)AFP、ALB、Wnt-1、Axin、β-catenin的影響。 結(jié)果： 1.苦參堿和丁酸鈉處理后卵圓細(xì)胞變大，核漿比減小，雙核細(xì)胞增多，隨著用藥濃度和時(shí)間的增加，變化越明顯。 2.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果：空白對(duì)照組：AFP、Wnt-1、A

10、xin、β-catenin表達(dá)陽(yáng)性，ALB表達(dá)陰性；苦參堿組和丁酸鈉組：AFP、Wnt-1、β-catenin表達(dá)明顯減弱，Axin表達(dá)增強(qiáng)，并且出現(xiàn)ALB的陽(yáng)性表達(dá)?？鄥A組和丁酸鈉組與空白對(duì)照組比較有顯著性差異，苦參堿組和丁酸鈉組之間比較無(wú)顯著差別。 結(jié)論： 1.苦參堿可抑制WB-F 344細(xì)胞增殖，且此抑制作用存在時(shí)間、劑量依賴性。 2.苦參堿可誘導(dǎo)細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞方向分化，此分化過(guò)程與下調(diào)Wnt信號(hào)通路的