JAK-STATs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在阿霉素腎臟纖維化大鼠模型中的研究及苦參堿對STAT3的影響.pdf

1、腎臟纖維化是各種原因腎臟疾病進展到慢性腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)，是各種腎小球病變發(fā)展至終末期的一種不可逆的病理改變，包括腎小球硬化、腎小管萎縮和毀損、細胞外基質(zhì)(ECM)異常增多和過度沉積等病理過程，其發(fā)病機制尚未完全明晰，治療難度大，預(yù)后較差，因此探討腎小球硬化機制及防治措施在臨床上有很重要的意義。 腎小球硬化初期表現(xiàn)為局灶節(jié)段性，后期則表現(xiàn)為彌漫性球狀分布，其病理演變過程分為腎小球肥大期、系膜硬化期、血管腔閉塞期，這一

2、演變過程是許多腎臟疾病進展到腎衰竭的共同道路[1]；JAKs/STATs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細胞因子實現(xiàn)生物學(xué)功能的主要途徑之一，它已成為當(dāng)前細胞因子研究領(lǐng)域的熱點。 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STATs)作為JAKs的靶蛋白，是存在于胞質(zhì)中的一個轉(zhuǎn)錄因子家族，STAT3是該家族的重要成員，是一類由細胞因子、生長因子等多肽類配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明STAT3途徑不僅是參與腎臟生理過程中是的一個很重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而且參與多種增生性

3、腎小球疾病有關(guān)[2,3]。 苦參堿(matrine)是藥用豆科槐屬植物苦參(Sophora flavescens Ait)的干燥根分離提取的生物堿，有多方面的藥理作用和功效，如抗菌、抗炎、抗風(fēng)濕、抗腫瘤、抗過敏、抗心律失常、消腫利尿、免疫及生物反應(yīng)調(diào)節(jié)作用等。研究發(fā)現(xiàn)苦參堿可降低腎病綜合征大鼠的蛋白尿和管型尿，減輕腎臟病理改變、減少足細胞融合，對TGF-β1的產(chǎn)生及Smad信號通路有一定的影響。近年來研究發(fā)現(xiàn)苦參堿具有就抑制成纖

4、維細胞及膠原合成，防治實驗性大鼠肝纖維化的作用。但其對腎小球硬化作用及機制目前尚未完全明晰。阿霉素所致的腎小球硬化動物模型是一穩(wěn)定的腎小球硬化模型，以大量蛋白尿為突出特點，具有慢性進展性腎損害的特點，與人類進行性腎臟疾病的表現(xiàn)非常類似。 本課題擬觀察腎小球硬化過程中大鼠腎臟STAT1、STAT3、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、Ⅳ型膠原(COL-Ⅳ)的變化及JAK2、STAT1、STAT3mRNA的表達，考察JAKs/STAT

5、s信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎小球硬化進程中的變化；同時觀察了該模型大鼠經(jīng)苦參堿干預(yù)治療后腎組織STAT3、TGF-β1蛋白表達及STAT3、PIAS3mRNA表達，探討苦參堿在腎小球硬化治療作用及其機制，為臨床防治腎小球硬化尋找新的途徑。 第一部分JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在阿霉素腎小球硬化大鼠模型中的研究目的：動態(tài)觀察阿霉素腎小球硬化大鼠模型腎臟纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路各信號分子的表達，探討JAK/STAT信

6、號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路腎小球硬化發(fā)病機制中的作用。 方法：30只健康雄性Wistar大鼠隨機分為模型組和對照組各15只，模型組左側(cè)腎切除及1周后尾靜脈注射阿霉素5mg/kg制備腎小球硬化模型；對照組行假手術(shù)及1周后尾靜脈注射同劑量蒸餾水，2、4、6周分批處死模型組及對照組各5只大鼠，檢測血清肌酐、尿素氮和24小時蛋白尿變化，HE和Masson染色觀察腎小球硬化指數(shù)變化，以免疫組化法觀察腎臟纖維化過程中大鼠腎臟STAT1、STAT3、TGF-

7、β1、COL-Ⅳ表達及采用熒光實時定量PCR的方法檢測JAK2、STAT1、STAT3mRNA表達。 結(jié)果：模型組血清肌酐(123.3±20.9μmol/L)、尿素氮(25.8±3.8μmol/L)和24小時蛋白尿(58.9±9.7mg/d)從2周起逐漸增高，至第6周明顯高于正常對照組(68.3±8.3 μmol/L)、(14.8±2.0μmol/L)和(9.6±1.1mg/d)(P<0.05)；模型組腎小球硬化指數(shù)(71.7±

8、11.2％)明顯高于正常對照組(17.6±2.5％)(p<0.05)；TGF-β1、COL-Ⅳ在6周腎小球硬化大鼠模型腎皮質(zhì)表達(TGF-β1:2.196±0.394％；COL-Ⅳ：5.26±1.66)明顯多于對照組(TGF-β1:0.017±0.005％；STAT3:7.64±1.25％)(p<0.05)，呈逐漸升高趨勢，模型制備成功；STAT3(19.6±2.6％)蛋白從4周起表達較正常對照組(7.64±1.2％)明顯增高(p<0.

9、05)，主要以胞漿表達陽性為主，部分呈胞核表達陽性；但STAT1蛋白表達模型組(6.76±1.1％)與對照組(5.73±1.0％)無明顯差別；JAK2、STAT1、STAT3mRNA6周后模型組表達(7.28±1.53、4.13±0.34、5.06±0.26倍于對照組)明顯多于對照組(P<0.05)。 小結(jié)：JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了腎小球硬化形成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，伴隨著JAK2、STAT1、STAT3信號分子表達的增多以

10、及TGF-β1、COL-Ⅳ等蛋白表達增加，這條通路可能是介導(dǎo)腎臟細胞外基質(zhì)大量沉積、腎臟纖維化發(fā)生及發(fā)展的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。而STAT1 mRNA表達升高，STAT1蛋白表達卻升高不明顯，可能與體內(nèi)代償機制及蛋白質(zhì)-mRNA表達不同步有關(guān)。 第二部分苦參堿對阿霉素誘導(dǎo)的腎小球硬化大鼠STAT3信號分子的影響目的：動態(tài)觀察苦參堿對阿霉素誘導(dǎo)的腎小球硬化大鼠STAT3分子及其抑制分子PIAS3變化的影響，探討苦參堿在腎小球硬化

11、發(fā)病進程中的作用及其機制。 方法：45只健康雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組及試驗組各15只，用單側(cè)腎切除加1wk后尾靜脈注射阿霉素(5mg/kg)的方法建立腎小球硬化大鼠模型，為模型組；只行手術(shù)不注射阿霉素為對照組；造模后即予苦參堿100 mg/kg·d灌胃干預(yù)治療為試驗組。于2、4、6 wk分批處死每組各5只大鼠，以免疫組化檢測腎臟STAT3、TGF-β1表達，實時熒光定量PCR技術(shù)觀察STAT3、PIAS3 mR

12、NA表達。 結(jié)果：第6wk時，模型組腎小球硬化指數(shù)(71.7±11.2％)高于對照組(17.6±2.5％)及試驗組(44.9±8.9％)(p<0.01)；模型組TGF-β1在腎皮質(zhì)表達(2.196±0.394％)多于對照組(0.017±0.005％)及試驗組(0.750±0.089％)(p<0.01)，并呈逐漸升高趨勢；模型組STAT3蛋白(19.58±2.66％)表達較對照組(7.64±1.25％)增高(P<0.01)，試驗組

13、(14.90±1.66％)較模型組(19.58±2.66％)降低(P<0.01)；模型組STAT3 mRNA表達為5.06±0.26倍于對照組，高于試驗組的3.49±0.39倍(p<0.01)，而PIAS3 mRNA呈相反趨勢。 小結(jié)：苦參堿有抑制腎小球硬化進展的作用，其作用機制可能為下調(diào)JAK/STAT通路信號分子STAT3及上調(diào)其抑制分子PIAS3的表達，降低TGF-β1的蛋白水平，從而延緩腎小球硬化進程。 結(jié)論：

14、 1.JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了腎小球硬化形成的過程，其信號分子JAK2、STAT1、STAT3是其中重要的環(huán)節(jié)之一； 2.TGF-β1、COL-Ⅳ等蛋白可能通過直接刺激JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路JAK2、STAT1、STAT3信號分子的活化，來介導(dǎo)腎小球硬化的進程；抑或JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)了TGF-β1、COL-Ⅳ等致纖維化因子的產(chǎn)生。 3.苦參堿可下調(diào)STAT3及上調(diào)其抑制分子PIAS3的