光親和標(biāo)記技術(shù)鑒別黃酮促葡萄糖吸收的靶點.pdf

1、黃酮類化合物普遍具有降糖活性，且毒性和副作用較低，可作為治療糖尿病的功能食品或藥物。黃酮類化合物可以通過促細(xì)胞葡萄糖吸收進(jìn)而降低血糖，研究顯示，其主要通過增加胰島素敏感性、促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等作用來促進(jìn)細(xì)胞的葡萄糖攝取，但發(fā)揮促細(xì)胞葡萄糖攝取的靶標(biāo)尚不清楚。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用小分子探針技術(shù)確認(rèn)藥物的靶點以及藥物和靶點之間的相互作用方式，是一個有效的手段。
　　本論文對17種黃酮進(jìn)行了活性篩選，發(fā)現(xiàn)5,6,7-三甲氧基黃

2、酮、槲皮素、厚樸酚和二氫楊梅素能顯著性地促進(jìn)HepG2細(xì)胞的葡萄糖吸收活性，同時只有5,6,7-三甲氧基黃酮無抑制 HepG2細(xì)胞增殖的活性。因此該化合物適合進(jìn)行標(biāo)記研究黃酮促細(xì)胞葡萄糖攝取的靶點。
　　設(shè)計并合成了一種基于5,6,7-三甲氧基黃酮的光親和探針BE-9。在5,6,7-三甲氧基黃酮B環(huán)4'位引入疊氮光親和基團(tuán)，使其共價標(biāo)記蛋白，A環(huán)5位引入炔丙基以引入報告基團(tuán)，便于和報告基團(tuán)羅丹明或生物素結(jié)合。主要的中間產(chǎn)物 BE-

3、1、BE-4、BE-5、BE-6、BE-7、BE-8以及最終產(chǎn)物BE-9都進(jìn)行了質(zhì)譜和核磁的表征，以確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。此外，我們還設(shè)計并合成了不同長碳鏈的羅丹明 B-N3的報告基團(tuán)，以摸索報告基團(tuán)所需合適的碳鏈長度。我們對其中的中間產(chǎn)物 RB-1、RB-2、RB-3、RB-4、RB-5、RB-6進(jìn)行了質(zhì)譜的表征，以確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。這種光親和探針BE-9可以用來標(biāo)記細(xì)胞中的靶蛋白，并通過羅丹明B進(jìn)行檢測或生物素富集以及純化靶蛋白。測定了合成的光親和

4、探針BE-9和原型化合物5,6,7-三甲氧基黃酮對HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收和增殖抑制活性。結(jié)果表明，探針BE-9可以顯著性地增加HepG2細(xì)胞吸收的葡萄糖量，與5,6,7-三甲氧基黃酮的活性無顯著性差異，而BE-9和5,6,7-三甲氧基黃酮對HepG2細(xì)胞的增殖作用較弱，說明探針和原型化合物可以專一性地促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收。
　　利用光親和探針BE-9對HepG2細(xì)胞中的蛋白進(jìn)行標(biāo)記，摸索了影響click反應(yīng)的條件，同時發(fā)