以人胰葡萄糖激酶為靶的降糖活性因子篩選平臺(tái)的建立.pdf

1、人胰葡萄糖激酶(PGK)具有調(diào)節(jié)肝臟中葡萄糖代謝和刺激胰腺B細(xì)胞分泌胰島素的雙重作用，是治療II型糖尿病(DM)研究的一個(gè)重要新型靶點(diǎn)?；谠摪悬c(diǎn)篩選得到的葡萄糖激酶激動(dòng)劑(GKAs)可能對(duì)DM治療具有應(yīng)用前景，已成為藥學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近幾年，國(guó)內(nèi)外研究人員采用的體外篩選平臺(tái)往往使用動(dòng)物來(lái)源的GK，主要建立在葡萄糖激酶(GK)的酶活測(cè)定體系上，且沒(méi)有對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。因此，該體系篩選得到的GKAs假陽(yáng)性率高，往往浪費(fèi)大量的

2、人力和物力。綜上所述，建立可靠、靈敏的體外篩選平臺(tái)對(duì)新型降糖藥物的研發(fā)具有重要意義。 本論文在大腸桿菌(E.coli)中成功表達(dá)人PGK，并對(duì)其進(jìn)行純化，然后用該酶建立高通量的體外降糖活性因子篩選平臺(tái)。主要研究?jī)?nèi)容如下： 1.通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增人胰葡萄糖激酶基因；以質(zhì)粒6HisT-pRSET為表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒6HisT-pRSET-PGK，轉(zhuǎn)化E.coliBL21；以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，通過(guò)

3、SDS-PAGE鑒定重組蛋白在E.coliBL21中的表達(dá)及其表達(dá)形式； 2.采用Ni-NTAHis.BindResin層析純化帶有6His·Tag的重組蛋白PGK；純化后的重組蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE和QuantityOne凝膠圖象處理軟件分析表明其純度為100％；采用Bradford蛋白測(cè)定法得出純化后重組蛋白的濃度約2.07mg/mL； 3.采用雙酶偶聯(lián)酶活測(cè)定法，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定產(chǎn)物B-NADPH

4、的生成量，測(cè)定純化得到的重組蛋白PGK活性，發(fā)現(xiàn)PGK的比活力約3.77U/mg； 4.采用響應(yīng)面分析法(RSM)，以人PGK為降糖活性因子作用靶點(diǎn)，GKARO-28-1675對(duì)PGK的激活率為響應(yīng)值，對(duì)篩選體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到該篩選平臺(tái)的最優(yōu)條件如下： 4.1反應(yīng)體系：總體積為150μL，含終濃度分別為60mMTris，2.11mMMgCl2，4.0mMATP，6.0mMB-D(+)Glucose，1.0m