硼替佐米或聯(lián)合三氧化二砷逆轉(zhuǎn)HL60-ADR細胞耐藥及其機制的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 盡管急性白血病的治療效果近年來有了較明顯的提高,但仍然有15～30％的病人發(fā)生原發(fā)性耐藥,60～80％的患者完全緩解后因繼發(fā)性耐藥復發(fā)而死亡[1]。隨著生物學技術(shù)快速發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)真核細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解大部分是通過泛素-蛋白酶體通路(Ubiquitin-Protease Pathway,UPP)完成,人白血病細胞含有異常高水平的蛋白酶體活性,且在誘導終末白血病細胞分化時蛋白酶體迅速被下調(diào),表明蛋白酶體的活性與白

2、血病細胞的惡性增殖有著密切相關(guān)性,因此蛋白酶體可能成為白血病治療的新靶點[2]。
　　 目前研究證實,蛋白酶體在細胞內(nèi)蛋白降解、MHC-Ⅰ類抗原遞呈、細胞內(nèi)部錯誤折疊蛋白的修復上發(fā)揮著重要的功能,多種與細胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡相關(guān)的蛋白的正常代謝,都與其功能的正確執(zhí)行密切相關(guān)。特異性阻斷蛋白酶體功能顯著改變以上蛋白在細胞內(nèi)的表達水平,導致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝發(fā)生紊亂,從而誘導細胞發(fā)生凋亡,是目前認識的蛋白酶體抑制劑主要的抗腫

3、瘤作用機制[3]。
　　 硼替佐米(bortezomib)是第一個被美國FDA批準用于臨床的蛋白酶體抑制劑,最開始用于難治、復發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)的治療[4]。后來多項臨床試驗表明硼替佐米單獨或聯(lián)合其他藥物治療非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、成人T細胞白血病、肺癌、卵巢癌等也具有良好效果[5]。有關(guān)硼替佐米治療耐藥急性髓系白血病的研究至今很少,我們前期工作中發(fā)現(xiàn)硼替佐米體外能夠抑制急

4、性髓系白血病細胞株HL60的增殖并誘導其凋亡,與三氧化二砷(As2O3)聯(lián)合后作用明顯增強[6-9],但它們對多藥耐藥的急性髓系白血病細胞株HL60/ADR的作用如何,及其作用機制尚未清楚,此乃是本研究立題的主要動機。
　　 研究方法:
　　 選擇急性髓系白血病多藥耐藥細胞株HL60/ADR為研究對象。應(yīng)用MTT法比較HL60/ADR和HL60細胞對阿霉素的敏感性,以耐藥倍數(shù)大于30倍定義為耐藥。加入非細胞毒濃度的硼替佐

5、米(細胞存活率大于95％)共同培養(yǎng)后,檢測HL60/ADR的阿霉素耐藥倍數(shù)變化。
　　 然后用MTT法確定硼替佐米和三氧化二砷的IC50值。將48小時IC50三氧化二砷(15n μM)與不同濃度(10～50nm)硼替佐米聯(lián)合處理HL60/ADR細胞,以空白處理組為對照,計算細胞的增殖抑制率并與三氧化二砷單藥組進行比較,觀察三氧化二砷與不同濃度硼替佐米聯(lián)合的作用。
　　 在上述實驗的基礎(chǔ)上,得出與48h IC50三氧化二砷

6、有協(xié)同增殖抑制作用的硼替佐米劑量(10nM),將實驗分為10nM和20nM硼替佐米單藥處理組、48h IC50三氧化二砷單藥處理組、10nM硼替佐米聯(lián)合48h IC50三氧化二砷處理組,以空白處理組為對照組。應(yīng)用Hoechst33342染色觀察細胞凋亡、AnnexinⅤ-EGFP/PI染色流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率,同時應(yīng)用流式細胞儀檢測HL60/ADR細胞的阿霉素陽性率、多藥耐藥相關(guān)蛋白1表達率,再用Western blot法檢測I κ

7、 B α、p65、bcl-2、bax、caspase-3、caspase-9、PARP蛋白的表達,熒光定量RT-PCR檢測PDCD7、APP基因的表達。
　　 HL60/ADR細胞及HL60細胞的24小時阿霉素IC50值的比較,加硼替佐米與否HL60/ADR細胞的24小時阿霉素IC50值的比較采用兩樣本t檢驗。不同時間、不同濃度硼替佐米組處理HL60/ADR細胞的增殖抑制率的比較用析因分析,48h IC50三氧化二砷和不同濃度硼

8、替佐米聯(lián)合處理組細胞增殖抑制率與相同劑量硼替佐米單藥組的比較用兩樣本t檢驗。不同時間、不同濃度硼替佐米單藥組或聯(lián)合三氧化二砷處理組的細胞凋亡率、多藥耐藥相關(guān)蛋白1表達的比較采用析因分析,同一時間不同實驗組之間的比較采用單因素方差分析。硼替佐米、三氧化二砷單藥或聯(lián)合處理HL60/ADR細胞后阿霉素陽性率的比較,各目的蛋白、目的基因表達量的比較均采用單因素方差分析,兩兩比較在方差齊性時采用LSD法,方差不齊時用Dunnett T3法,P<0

9、.05為差異具有顯著性水平。
　　 結(jié)論:
　　 1、硼替佐米能使HL60/ADR白血病細胞的耐藥倍數(shù)降低。
　　 2、硼替佐米單藥對HL60/ADR白血病細胞具有抑制增殖的作用,其效果呈時間-劑量依賴性。
　　 3、硼替佐米能夠誘導HL60/ADR白血病細胞凋亡,其作用隨著時間的延長和劑量的增加而增強。
　　 4、硼替佐米能夠提高HL60/ADR.白血病細胞內(nèi)阿霉素的蓄積量,隨著劑量增加作用增強

10、。
　　 5、硼替佐米與三氧化二砷聯(lián)合作用于HL60/ADR白血病細胞的上述效果均比兩者單藥處理時的作用效果顯著增加。
　　 6、硼替佐米能夠降低HL60/ADR白血病細胞的多藥耐藥相關(guān)蛋白1的表達,其作用呈時間-劑量依賴性,與三氧化二砷聯(lián)合作用更明顯,這與其增加HL60/ADR細胞內(nèi)阿霉素濃度、逆轉(zhuǎn)細胞耐藥密切相關(guān)。
　　 7、硼替佐米能夠穩(wěn)定I-KB、抑制NF-κB活化,及抑制抗凋亡蛋白、增加促凋亡蛋白表達、