硼替佐米耐藥骨髓瘤細(xì)胞株的建立及其耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的和意義： 多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是最為常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)生率占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10％左右，隨著人口的老齡化，該病的發(fā)生率在我國呈逐年增高的趨勢。目前，所有的治療手段包括化療、放療、造血干細(xì)胞移植以及一些新型的分子靶向藥物。但迄今為止MM仍是一種不可治愈性疾病。研究顯示，蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib/PS-341，商品名VElCADE(R))可誘導(dǎo)包括地塞米松、美法

2、侖以及沙利度胺耐藥刪細(xì)胞在內(nèi)的MM細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，已在刪的治療中顯示出了較好的療效。其主要作用機(jī)制為通過靶向性作用于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，抑制核因子κ B(nuclear factor-kappa B，NF-κB)的活性以發(fā)揮抗腫瘤作用。 硼替佐米為哺乳動物細(xì)胞中26S蛋白酶體糜蛋白酶樣活性的可逆抑制劑，化學(xué)名為：[(1R)-3-甲基-1[[(2S)-1氧-3-苯基-2-[(吡嗪羧基)氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸，分子式C19H25

3、BN404，相對分子量384.24。它是首個(gè)獲美國FDA批準(zhǔn)用于MM臨床治療的蛋白酶體抑制劑，具有特異性強(qiáng)效、高效的特點(diǎn)。Mateos等報(bào)道，采用硼替佐米聯(lián)合MP(VMP方案)治療60例65歲及以上的老年初診MM患者，總反應(yīng)率為89％，CR率為32％，16個(gè)月的無事件生存率(EFS)為93％；而歷史對照的MP方案總反應(yīng)率為42％，16個(gè)月的EFS為51％。2008年NCCN骨髓瘤診療指南中也推薦將VD(硼替佐米+地塞米松)、PAD(硼替

4、佐米+地塞米松邯可霉素)、MPV(美法侖+強(qiáng)的松+硼替佐米)用于初發(fā)及移植候選的MM患者。對于難治/復(fù)發(fā)的MM患者2008年NCCN指南中將硼替佐米單藥及硼替佐米聯(lián)合脂質(zhì)體阿霉素作為Ⅰ類推薦，硼替佐米+地塞米松方案作為2A類推薦。 然而，硼替佐米尚不能根治MM，且隨著其臨床應(yīng)用范圍的擴(kuò)大和時(shí)間的推移，國內(nèi)外臨床研究已發(fā)現(xiàn)部分刪患者對硼替佐米產(chǎn)生了耐藥反應(yīng)或在初期治療有效的MM患者中出現(xiàn)耐藥及疾病的復(fù)發(fā)，從而影響了硼替佐米的療效。

5、目前，研究發(fā)現(xiàn)MM患者中硼替佐米耐藥主要與NF-κ B途徑、熱休克蛋白及BCL蛋白家族的過表達(dá)現(xiàn)象有關(guān)。因此，繼續(xù)尋找有效方案以預(yù)防耐藥的發(fā)生或根除惡性漿細(xì)胞克隆，是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 目前，國內(nèi)外關(guān)于硼替佐米的耐藥機(jī)制研究尚少，其耐藥機(jī)制尚不明確。有研究國外分析了多藥物耐藥蛋白(MRP)在刪細(xì)胞中的表達(dá)與硼替佐米誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡間的相關(guān)性，研究顯示MRP3和MRP5的表達(dá)不足以遏制硼替佐米誘導(dǎo)產(chǎn)生的凋亡作用，從而提示硼替佐米

6、可能并非為多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物。這就提示，硼替佐米的耐藥不同于現(xiàn)有腫瘤治療中經(jīng)典的多藥耐藥。 因此，如果能建立硼替佐米耐藥的MM細(xì)胞株，可以深入研究硼替佐米可能的耐藥機(jī)制，為臨床應(yīng)用蛋白酶體抑制劑治療MM，監(jiān)測和避免治療中耐藥的發(fā)生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；同時(shí)，為抗耐藥藥物的篩選提供細(xì)胞模型，以期達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥提高療效的目的。為此，本研究擬通過建立硼替佐米耐藥的刪細(xì)胞株，對其進(jìn)行基因組學(xué)及差異蛋白組學(xué)的研究以期初步探討其可能的耐藥機(jī)制，為

7、臨床克服硼替佐米耐藥提供細(xì)胞模型及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究包括以下兩個(gè)部分： 第一部分硼替佐米耐藥骨髓瘤細(xì)胞株的建立及其基因表達(dá)譜研究 方法：采用濃度遞增的方法自MM細(xì)胞系NCI-H929建立了硼替佐米耐藥株NCI-H929B。MTT實(shí)驗(yàn)測得硼替佐米對親本NCI-H929和NCI-H929B24h的IC50值。流式細(xì)胞術(shù)分析兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況。提取NCI-H929、NCI-H929B兩種mRNA分別變性及逆轉(zhuǎn)錄至cDNA

8、，進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。對基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行GO-分析和Pathway-分析，從中發(fā)現(xiàn)可能與耐藥相關(guān)的信號通路，及其相互激活關(guān)系。采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，對重要通路上相關(guān)基因(Casp7、TRAF2、FADD、Casp8，MAP3K5、Hsp86)進(jìn)行驗(yàn)證。并選取Caspase8抑制劑進(jìn)行干預(yù)，檢測親本NCI-H929細(xì)胞系對硼替佐米的IC50變化情況。 結(jié)果：采用濃度遞增法自MM細(xì)胞系NCI-H929建立了硼替佐米耐藥株NCI

9、-H929B。MTT實(shí)驗(yàn)測得硼替佐米對親本NCI-H929和NCI-H929B24h的IC50分別為20.7nmol/L和487.4nmol/L，耐藥倍數(shù)為23.5。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示親本NCI-H929和NCI-H929B的細(xì)胞周期分布無顯著性差異。 提取親本NCI-H929、NCI-H929B兩種mRNA分別變性及逆轉(zhuǎn)錄至cDNA，進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，結(jié)果顯示與親本NCI-H929相比，在NCI-H929B中有317個(gè)基因表

10、達(dá)上調(diào)，而356個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。對基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行GO-分析和Pathway一分析，從中發(fā)現(xiàn)可能與耐藥相關(guān)的信號通路，及其相互激活關(guān)系，結(jié)果提示凋亡通路、細(xì)胞周期等信號通路可能與硼替佐米耐藥的產(chǎn)生相關(guān)。采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，對重要通路上相關(guān)基因(Casp7、TRAF2、FADD、Casp8，MAP3K5、Hsp86)進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)候選基因在耐藥株中表達(dá)/親本細(xì)胞中表達(dá)≥1.5時(shí)，則認(rèn)為該基因?yàn)檫^表達(dá)，若是≤0.5則判定該基因?yàn)榈捅磉_(dá)

11、，結(jié)果顯示在NCI-H929B細(xì)胞株中FADD、Casp8，MAP3K5表達(dá)下調(diào)，而Hsp86表達(dá)上調(diào)。采用Caspase8抑制劑進(jìn)行干預(yù)，檢測親本NCI-H929細(xì)胞系對硼替佐米的IC50變化情況，結(jié)果顯示加入抑制劑后，NCI-H929細(xì)胞系對硼替佐米的IC50增高4.37倍。 結(jié)論：通過體外濃度遞增法可建立蛋白酶體抑制劑硼替佐米耐藥的MM細(xì)胞株。親本NCI-H929和NCI-H929B的生長曲線和細(xì)胞周期分布無顯著性差異?；?/p>

12、因表達(dá)譜及Pathway分析顯示親本NCI-H929和NCI-H929B細(xì)胞系間存在多個(gè)差異表達(dá)基因，而凋亡、細(xì)胞周期通路在耐藥的產(chǎn)生中可能起著重要作用。Caspase8的表達(dá)受抑制可能是耐藥細(xì)胞株產(chǎn)生耐藥的重要因素之一。 第二部分硼替佐米敏感與硼替佐米耐藥骨髓瘤細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究 方法：提取NCI-H929、NCI-H929B兩種細(xì)胞的蛋白，采用雙向電泳及質(zhì)譜鑒定技術(shù)，分析差異蛋白的表達(dá)情況。并選取其中部分差異蛋白

13、，采用western-blot技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。留取臨床患者原代標(biāo)本，進(jìn)行western-blot檢測，進(jìn)一步驗(yàn)證雙向電泳結(jié)果，并分析差異蛋白與硼替佐米耐藥的相關(guān)性。 結(jié)果：通過雙向電泳及質(zhì)譜鑒定后共鑒定出14個(gè)差異蛋白，與親本NCI-H929細(xì)胞相比，在NCI-H929B中上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)有11個(gè)，分別為HSP75、α烯醇化酶、蛋白二硫化物異構(gòu)酶A3、磷酸化應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白1、膜聯(lián)蛋白A1、脫氧核糖核酸酶TATDN1、HSPβ-1、蛋白

14、DJ-1、微管蛋白β-6、角蛋白KRT1、加帽蛋白Zβ；下調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)有3個(gè)，分別為腺苷高半胱氨酸水解酶、ATP合成酶β亞單位和Rho-GDP解離抑制因子β。通過western Blot技術(shù)檢測了在NCI-H929B雙向電泳中顯示為高表達(dá)的蛋白DJ-1，結(jié)果顯示NCI-H929B中蛋白DJ-1表達(dá)水平增高。采用CD138磁珠分選技術(shù)獲得7名MM患者的原代刪細(xì)胞標(biāo)本，通過western Blot技術(shù)檢測顯示硼替佐米耐藥的原代刪細(xì)胞標(biāo)本中蛋