硼替佐米對(duì)人骨髓增生異常綜合征細(xì)胞株MUTZ-1作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一組異質(zhì)性造血干細(xì)胞克隆性疾病。以骨髓病態(tài)造血為特征，進(jìn)行性、難治性外周血紅細(xì)胞、粒細(xì)胞及血小板減少為主要臨床表現(xiàn)。盡管傳統(tǒng)的對(duì)癥支持、化學(xué)療法、激素和細(xì)胞因子治療，近年來(lái)出現(xiàn)的多種新型藥物，如免疫調(diào)節(jié)劑和誘導(dǎo)分化劑等，能夠緩解疾病，延長(zhǎng)患者的生存期，但目前本病仍缺乏有效的根治方法，又具有向白血病轉(zhuǎn)化的高風(fēng)險(xiǎn)，故近年WHO分型已將MDS歸類(lèi)為

2、髓系造血系統(tǒng)惡性疾病。硼替佐米(Bortezomib，PS-341)是丙氨基酸硼酸衍生物的一種，為新型蛋白酶體抑制劑，因其獨(dú)特的抗腫瘤機(jī)制，臨床已經(jīng)廣泛用于多發(fā)性骨髓瘤和其他系統(tǒng)惡性腫瘤的治療。但是目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)PS-341對(duì)MDS細(xì)胞的作用罕見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究PS-341對(duì)人MDS細(xì)胞株MUTZ-1的作用并初步探討可能的作用機(jī)制，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.采用MTT比色法檢測(cè)PS-341對(duì)人MDS細(xì)胞株

3、MUTZ-1體外生長(zhǎng)的抑制作用。 2.瑞氏-姬姆薩(Wright-Giemsa)染色，油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。 3.應(yīng)用流式細(xì)胞儀，AnnexinⅤ和PI雙染色，分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 4.Western-blot方法檢測(cè)PS-341對(duì)MUTZ-1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PARP和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響。 5.Western-blot方法檢測(cè)PS-341對(duì)MUTZ-1細(xì)胞Bcl-2家族蛋白Bcl-2，Mcl-1

4、和Bax蛋白表達(dá)的影響。 6.采用MTT比色法檢測(cè)PS-341作用下，MUTZ-1細(xì)胞株對(duì)三氧化二砷的敏感性交化。 結(jié)果： 1.PS-341抑制MUTZ-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性： MTT比色法檢測(cè)結(jié)果顯示，0～160 ng/ml PS-341處理MUTZ-1細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，能夠明顯抑制MUTZ-1細(xì)胞增殖，各組間差異顯著(P值均小于0.01)。且生長(zhǎng)抑制率與藥物作用濃度呈正相

5、關(guān)(P<0.01)。PS-341處理細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，MUTZ-1的IC50分別各為56.1ng/ml；34.2ng/ml；24.3ng/ml. 2.PS-341誘導(dǎo)MUTZ-1細(xì)胞凋亡，呈濃度依賴(lài)性： 采用瑞氏-姬姆薩染色，油鏡下觀察PS-341作用前后MUTZ-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示，20～80ng/ml的PS-341處理24小時(shí)后，MUTZ-1細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征，如胞漿空泡化，細(xì)胞體

6、積縮小，細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚、邊緣化，形成新月型核或環(huán)形核，細(xì)胞核碎裂，凋亡小體形成等。以流式細(xì)胞分析技術(shù)研究了細(xì)胞DNA含量及磷脂酰絲氨酸(PS)轉(zhuǎn)位。PI的DNA染色結(jié)果顯示，0～80ng/ml的PS-341作用24小時(shí)，AnnexinⅤ-PI雙標(biāo)記法結(jié)果顯示：以PS-341不同濃度20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml處理MUTZ-1細(xì)胞24小時(shí)，結(jié)果顯示，0～80ng/ml的PS-341處理MUTZ-1細(xì)胞24小時(shí)，早期凋亡

7、細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為：15.3％，21.8％，35.4％(空白對(duì)照組為2.3％)，晚期凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為：20.4％，30.3％，36.7％，早期細(xì)胞凋亡率與藥物作用濃度呈正相關(guān)(r=0.986，P<0.01)。 3.PS-341誘導(dǎo)Caspase-3依賴(lài)型MDS細(xì)胞凋亡： 20～80ng/mlPS-341作用MUTZ-1細(xì)胞12小時(shí)后，Caspase-3和PARP蛋白都出現(xiàn)明顯的激活帶，光密度掃描顯示，Caspase-3

8、和PARP蛋白激活帶表達(dá)水平與PS-341作用濃度存在正相關(guān)。提示PS-341通過(guò)激活Caspase-3途徑誘導(dǎo)MDS細(xì)胞凋亡。 4.PS-341通過(guò)影響B(tài)cl-2家族蛋白Bcl-2、Mcl-1和Bax蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)MDS細(xì)胞凋亡： 20～80ng/ml PS-341作用MUTZ-1細(xì)胞12小時(shí)后，Bcl-2、Mcl-1表達(dá)水平顯著下調(diào)，Bax表達(dá)水平上調(diào)，光密度掃描示，Bcl-2、Mcl-1的蛋白表達(dá)水平與PS-341

9、作用濃度存在負(fù)相關(guān)，Bax蛋白表達(dá)水平與PS-341作用濃度呈正相關(guān)，提示PS-341可能通過(guò)改變Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的蛋白表達(dá)比例，促使細(xì)胞色素C等多種凋亡因子的釋放，誘導(dǎo)MDS細(xì)胞凋亡。 5.PS-341增強(qiáng)MUTZ-1細(xì)胞對(duì)三氧化二砷的敏感性： 分別單獨(dú)及聯(lián)合以PS-3410～80ng/ml，As2O30.25～2μmol/L處理MUTZ-1細(xì)胞24小時(shí)，MTT比色法測(cè)定抑制率。結(jié)果顯示，在一定濃度

10、范圍內(nèi)，PS-341與As2O3聯(lián)用效果優(yōu)于單用，且細(xì)胞抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)。 小結(jié)： 1.在體外，PS-341可直接抑制MDS細(xì)胞株MUTZ-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，并呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性； 2.20～80ng/ml PS-341處理一定時(shí)間后可明顯誘導(dǎo)MUTZ-1細(xì)胞凋亡，并呈濃度依賴(lài)性； 3.PS-341誘導(dǎo)Caspase-3依賴(lài)型MDS細(xì)胞凋亡，并呈濃度依賴(lài)性。 4.PS-341能下調(diào)Bcl-2和