硼替佐米對大鼠破骨細胞的影響.pdf

1、目的：通過RANKL定向誘導RAW264.7細胞為破骨細胞的方式建立破骨細胞模型，并對該細胞進行鑒定：由于硼替佐米可以通過影響骨髓瘤細胞介導細胞因子表達而間接影響到破骨細胞的分化成熟和功能，為進一步探討其直接影響破骨細胞的分化的作用，并對破骨細胞的標志物抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活力進行測定以觀察硼替佐米對破骨細胞功能影響。
　　方法：1、把RAW264.7細胞以1×105/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶內，預先將紫外照射過的圓形玻片

2、置于48孔板，設置5-6個復孔，是培養(yǎng)過夜后（細胞附上玻片），倒去培養(yǎng)液，換200μl的50 ng/ml的RANKL誘導，細胞每3 d換液1次。第3、6、9天分別取出圓玻片，用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒染色，光鏡下觀察多核細胞的形態(tài)學及組織化學特點。2、觀察在小鼠破骨細胞株體外誘導分化成熟過程中，硼替佐米對其分化和功能的影響。在誘導向破骨細胞分化過程中，采用 A組和 B組骨板骨吸收情況對比的方法：A組和 B組的細胞密度為105

3、/ml，A組的RAW264.7用100ng/ml的RANKL誘導分化，3天換液1次；B組的細胞培養(yǎng)基里除了含有100ng/ml的RANKL，還有10.0nM/ml的硼替佐米，3天換液1次，第14天觀察到骨片上骨陷窩的，與對照組比較，得出結論。3、將細胞以1*105的密度鋪在48孔培養(yǎng)板上，設5個復孔，培養(yǎng)過夜后，換含有sRANKL和硼替佐米的培養(yǎng)液共同培養(yǎng)，使RANKL的濃度為50ng/ml，硼替佐米濃度分別為0.1nM/ml,1nM/

4、ml,10nM/ml，培養(yǎng)9天后取上清液待測。用抗酒石酸酸性磷酸酶測試盒測量OD值并計算出活性值，
　　結果:1、誘導培養(yǎng)3天后可見少量活性良好的破骨樣細胞，胞質內可見透亮區(qū)，且胞質內含許多紅色陽性顆粒，此為TRAP染色(十)顆粒，細胞內可見淡染的雙核，三個核以上的細胞未觀察到。誘導培養(yǎng)6天后可見大量TRAP染色(+)破骨樣細胞，此時細胞核仍以雙核為主，可見少量多核細胞。誘導培養(yǎng)9天后出現(xiàn)多核巨型TRAP染色(+)破骨樣細胞，細胞

5、較第3，6天明顯增大，細胞核可達到3個以上。2、通過A組和B組骨吸收面積對比，發(fā)現(xiàn)硼替佐米干預的B組面積明顯少于無硼替佐米干預的A組。3、硼替佐米降低了小鼠破骨細胞中的trap活性。TRAP是破骨細胞標志物，它的降低說明硼替佐米可以抑制破骨細胞成熟，減少破骨作用。
　　結論：1、RANKL成功地把 RAW264.7細胞定向誘導成為破骨細胞。2、硼替佐米能顯著的減少破骨細胞骨質破壞作用。3、硼替佐米可以通過抑制TRAP分泌而達到抑制