黃芩苷對耐藥HL-60-ADR細(xì)胞及HL-60細(xì)胞裸鼠異種移植瘤的實驗研究.pdf

1、目的:(1)研究中藥黃芩苷(Baicalin)對耐阿霉素人髓系白血病HL-60/ADR細(xì)胞株增殖、凋亡的影響。觀察黃芩苷對HL-60/ADR細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)基因、凋亡相關(guān)蛋白表達及在PI3K/Akt/mTOR、MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中蛋白表達水平的影響，探討其作用機制。(2)研究黃芩苷對HL-60/ADR細(xì)胞耐藥相關(guān)基因和相關(guān)蛋白表達的影響，探討其是否具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用及可能機制。(3)研究黃芩苷對高致瘤HL-60細(xì)胞裸鼠異種移植瘤的作

2、用。 方法:(1)應(yīng)用MTT法繪制細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞克隆形成實驗觀察黃芩苷對HL-60/ADR細(xì)胞增殖的影響；Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞檢測、DNA倍體分析、末端缺口原位標(biāo)記(TUNEL)法及DNAF膠電泳分析細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期變化；RT-PCR檢測黃芩苷作用前后c-myc、bcl-2、hTERT、pim-2、mcl-1、p21等凋亡相關(guān)基因mRNA表達水平的變化，蛋白印跡法(Westem-Blot)檢測c-myc、b

3、cl-2、bad、caspase-3、PARP等凋亡相關(guān)蛋白和PI3K/Akt/mTOR、MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達水平的變化。(2)采用MTT法分別檢測阿霉素、柔紅霉素、阿糖胞苷、足葉乙甙對HL-60細(xì)胞和HL-60/ADR細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，以及加用黃芩苷時上述抑制作用的變化，并計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。RT-PCR和Westem Blot檢測黃芩苷作用后HL-60/ADR細(xì)胞耐藥相關(guān)基因和相關(guān)蛋白的表達，流式細(xì)胞術(shù)檢測黃芩苷作用前后HL-6

4、0/ADR細(xì)胞阿霉素蓄積水平。(3)構(gòu)建高致瘤HL-60細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，將荷瘤裸鼠隨機分為6組：陰性對照組、25mg/kg黃芩苷組、50mg/kg黃芩苷組、100mg/kg黃芩苷組、聯(lián)合用藥組(50mg/kg黃芩苷+2mg/kg VP16)和VP16陽性對照組(4mg/kg)。計算平均瘤重及抑瘤率。通過電鏡觀察瘤組織超微結(jié)構(gòu)，病理組織學(xué)觀察裸鼠各主要臟器結(jié)構(gòu)改變，瘤塊組織蛋白檢測信號轉(zhuǎn)到通路指標(biāo)。觀察裸鼠生存時間。 結(jié)果:(

5、1)細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示黃芩苷能明顯抑制HL-60/ADR細(xì)胞增殖，半數(shù)抑制濃度(IC50)約為28μmol/L：較低濃度黃芩苷即可抑制HL-60/ADR細(xì)胞集落的形成；Annexin V FITC/PI法檢測到早期凋亡細(xì)胞，DNA片段化、TUNEL法檢測到晚期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率呈濃度依賴性。細(xì)胞周期分析顯示，與對照組比較，40μmol/L、80μmol/L濃度組細(xì)胞被阻滯于G0/G1期比率明顯增高(P＜0.01)，S期細(xì)胞比率降低(

6、P＜0.01)，各濃度組均檢測到典型的亞二倍體峰(凋亡峰)。黃芩苷作用后HL-60/ADR細(xì)胞c-myc、bcl-2、hTERT、pim-2、mcl-1基因mRNA表達隨著作用時間的延長而逐漸減少；p21基因mRNA表達隨著作用時間的延長而逐漸升高。Westem-Blot的結(jié)果顯示c-myc、bcl-2、caspase-3(35kD)和PARP(116kD)蛋白的表達水平呈時間依賴性下降，而caspase-3(17kD、19kD)、PA

7、RP(85kD)及bad蛋白的表達則隨著作用時間的延長逐漸升高。黃芩苷下調(diào)了HL-60/ADR細(xì)胞的PI3K/Akt/mTOR和MAPK信號通路蛋白中p-Akt、NF-KB、p-NF-kB、p-IKB-α、mTOR、p-mTOR、p-GSK-3p、p-MAPK的表達，而Akt、IkB-α、GSK-3p和MAPK的表達與對照組相比無明顯改變。(2)黃芩苷能部分逆轉(zhuǎn)HL-60/ADR細(xì)胞的多藥耐藥性，阿霉素和黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用對HL-60/AD

8、R細(xì)胞的增殖抑制率明顯低于單用阿霉素者，阿霉素單用及聯(lián)合黃芩苷對HL-60細(xì)胞的增殖抑制率沒有影響。黃芩苷能下調(diào)mrp-1、lrp、GSTπ基因mRNA和mrp-1、GSTπ蛋白的表達，上調(diào)TopoIIα和TopoIIβ基因mRNA的表達(p＜0.05)。而Topo I基因在各組間表達無明顯差別。同時觀察到黃芩苷能使染上阿霉素?zé)晒獾腍L-60/ADR細(xì)胞比例增加。(3)黃芩苷可抑制裸鼠HL-60細(xì)胞皮下移植瘤的生長，呈劑量依賴性。100

9、mg/kg黃芩苷組和聯(lián)合用藥組(50mg/kg黃芩苷+2mg/kg VP16)的瘤塊重量明顯低于陰性對照組(p＜0.01)。瘤組織病理組織學(xué)和透射電鏡檢查結(jié)果顯示：黃芩苷用藥組和聯(lián)合用藥組的腫瘤壞死和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象較陰性對照組多見。黃芩苷可能通過抑制Akt活性，下調(diào)p-Akt、mTOR和p-mTOR的表達來抑制裸鼠異種移植瘤的增長；聯(lián)合用藥組中位生存期明顯高于陰性對照組(p＜0.05)，提示黃芩苷與VP16具有協(xié)同抗HL-60細(xì)胞裸鼠異種

10、移植瘤的作用。黃芩苷對裸鼠一般狀況和體重?zé)o不良影響，對裸鼠無明顯毒副作用。 結(jié)論:(1)黃芩苷能有效抑制HL-60/ADR細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。其機制可能與下調(diào)c-myc、bcl-2、hTERT、pim-2、mcl-1 mRNA和／或蛋白表達，上調(diào)p21、bad的表達有關(guān)。PI3K/Akt/mTOR、MAPK信號通路的改變可能參與了黃芩苷抑制HL-60/ADR細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的過程。(2)黃芩苷能部分逆轉(zhuǎn)HL-60/ADR細(xì)胞