轉(zhuǎn)錄因子CsMYB21與CsMYB77在柑橘果實成熟過程中的功能解析.pdf

1、我國生產(chǎn)供應(yīng)的鮮食柑橘種類主要為中熟，其熟期布局嚴(yán)重不均衡。分散品種熟期布局，擴大果品供給期，是柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。此前，關(guān)于影響柑橘熟期的糖酸合成分解途徑、類胡蘿卜合成分解途徑等已有較深入的研究，但關(guān)于影響其成熟的基因的功能探討仍較少。探究影響柑橘果實成熟的基因的表達與調(diào)控，有利于進一步挖掘其成熟過程在分子水平的機理，對調(diào)整柑橘果實熟期有重大的作用。本實驗以2個柑橘果實熟期相關(guān)基因CsMYB21與CsMYB77為對象，以‘奉節(jié)72-1

2、’(WT)臍橙與其晚熟芽變‘奉節(jié)晚橙’(MT)為試材，通過轉(zhuǎn)化Mic-Tom番茄，初步確定了基因CsMYB21與CsMYB77的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1、基因克隆與生物信息學(xué)分析:分別克隆2個轉(zhuǎn)錄因子在WT和MT中的基因全長與啟動子片段，且分析了其啟動子區(qū)順式作用結(jié)合元件。利用Clustalx1.81和Mega5.1軟件對2個基因氨基酸序列和擬南芥、番茄中MYB(v-myb avianmyeloblastosis vira

3、l oncogene homolog)家族進行進化樹分析，發(fā)現(xiàn)Cs2g27940與番茄Solyc02g067760.2.1和擬南芥AT3g27810(ATMYB21)，Cs3g23950與番茄Solyc04g079360.1.1和AT3g50060(ATMYB77)親緣關(guān)系最近，分別命名Cs2g27940、Cs3g23950為CsMYB21、CsMYB77。預(yù)測分析2個轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)大小、等電點、保守結(jié)構(gòu)域等一級結(jié)構(gòu)。2個目的基因的基

4、因全長和其啟動子序列在WT和MT中均無發(fā)生突變，啟動子的順式結(jié)合元件中均含有大量與光信號以及植物激素信號途徑相關(guān)的元件，說明其可能通過參與或影響光信號、激素信號途徑來影響果實的發(fā)育和成熟。
　　2、轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性檢測:克隆2個基因的CDS區(qū)，分別構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體和轉(zhuǎn)錄激活活性載體。通過將CsMYB21∷YFP和CsMYB77∷YFP注射本氏煙草下表皮中發(fā)現(xiàn)，兩種融合蛋白均在細(xì)胞核中表達。將融合表達載體pGBKT7-CsMYB2

5、1和pGBKT7-CsMYB77分別轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109后在不完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)，均正常生長。結(jié)果證明，CsMYB21和CsMYB77均是典型的MYB家族轉(zhuǎn)錄因子。
　　3、表達模式分析:利用qRT-PCR測定了2個轉(zhuǎn)錄因子在果實生長不同階段及各組織中的表達量。結(jié)果顯示，CsMYB77主要在果實發(fā)育早期表達，CsMYB21主要在發(fā)育后期表達;且2個目的基因在WT和MT兩個材料的各發(fā)育階段和各組織中表達差異較大。由此推測兩個基因可能