番茄SlHDA1-SlHDA3基因的克隆及在果實發(fā)育成熟過程中的功能研究.pdf

1、組蛋白乙?；腿ヒ阴；揎検钦婧松镏匾谋碛^遺傳調(diào)控方式之一，通過對組蛋白 N端末尾的修飾，達到調(diào)控真核生物基因表達的作用。組蛋白去乙酰化酶（HDACs）介導的乙?；揎椩谥参锷L發(fā)育及基因表達轉錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，擬南芥中組蛋白乙?；腿ヒ阴；揎椩谌旧w穩(wěn)定性、轉錄調(diào)控、植物發(fā)育及對外界脅迫響應方面具有重要作用，但對果實發(fā)育與成熟的生物學調(diào)控機制還不清楚。番茄(Solanum lycopersicum)作為研究果實

2、發(fā)育和成熟的理想模式植物，在果實相關的研究中具有明顯優(yōu)勢。相關研究數(shù)據(jù)表明SlHDA1和SlHDA3在番茄果實破色和成熟期表達量較高，可能參與果實成熟過程。由此，本論文以番茄作為研究材料，研究番茄組蛋白去乙?；讣易宄蓡TSlHDA1、SlHDA3對果實發(fā)育與成熟過程的影響，以期為揭示SlHDA1、SlHDA3對果實發(fā)育成熟的調(diào)控作用和相應的表觀遺傳調(diào)控機制，為改善番茄果實品質(zhì)奠定理論基礎。
　　本研究從番茄基因組中分離出SlHDA

3、1和SlHDA3兩個去乙酰化酶基因，分析其基因結構和蛋白保守功能域，構建了HDACs家族基因系統(tǒng)進化樹；分別對兩個基因進行了亞細胞定位分析，分析其在番茄中的時空特異表達模式；通過啟動子區(qū)域的元件分析、相應的激素和非生物脅迫處理，分析二者在相應條件下的表達模式；同時，構建了SlHDA1和SlHDA3基因的超表達和RNAi抑制表達載體，并轉化番茄，初步鑒定了轉基因株系的表型；并通過酵母雙雜交技術篩選出與SlHDA1和SlHDA3蛋白互作的果

4、實發(fā)育成熟相關的轉錄因子；初步研究了SlHDA1和SlHDA3基因在番茄果實發(fā)育和成熟過程中的生物學功能。主要研究結果如下：
　　一、通過對SlHDA1、SlHDA3基因結構分析發(fā)現(xiàn)，SlHDA1基因全長1497bp，含有8個外顯子，7個內(nèi)含子，編碼498個氨基酸；SlHDA3基因全長1416bp，含有6個外顯子，5個內(nèi)含子，編碼471個氨基酸。對兩個蛋白的保守功能域分析發(fā)現(xiàn)，SlHDA1和SlHDA3蛋白具有典型的精氨酸酶功能域

5、和組蛋白去乙?；腹δ苡?，且存在多個活性部位及金屬離子結合位點。
　　二、通過將番茄SlHDA1、SlHDA3基因編碼區(qū)序列與GFP基因融合，構建用于亞細胞定位的融合表達載體Sl-HDA1/HDA3:GFP，并轉化煙草懸浮細胞BY2原生質(zhì)體，通過瞬時表達，利用激光共聚焦顯微鏡對融合表達載體的GFP熒光在煙草BY2細胞中的位置進行觀察，發(fā)現(xiàn)番茄SlHDA1、SlHDA3基因所編碼蛋白定位于細胞核內(nèi)。
　　三、通過在線分析和定量

6、PCR方法對番茄SlHDA1、SlHDA3基因的時空特異性表達模式進行分析，結果表明SlHDA1、SlHDA3基因的表達具有組織特異性，均在花器官及果實中的表達量相對較高；在果實的發(fā)育階段，兩個基因均在破色時期和果實成熟后期有較高的表達量。
　　四、對啟動子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，兩個基因啟動子區(qū)域存在與茉莉酸甲酯（MeJA）和赤霉素（GA3）及一些與逆境相關的響應元件。通過相應的激素和脅迫處理分析兩個基因的響應模式，發(fā)現(xiàn)SlHDA1基因的

7、表達在轉錄水平上受到赤霉素和茉莉酸甲酯的調(diào)控，SlHDA3基因的表達在轉錄水平上受到赤霉素的調(diào)控；脅迫處理結果表明SlHDA1和SlHDA3可能參與植物體對外界溫度及鹽脅迫的響應過程。
　　五、通過對轉基因植株的表型鑒定發(fā)現(xiàn)，兩個基因的超表達株系中均出現(xiàn)番茄果實變小及種子數(shù)量減少的表型，而SlHDA3 RNAi抑制表達株系的果實出現(xiàn)表面色素分布不均的現(xiàn)象，且成熟后始終呈橙紅色。初步推測SlHDA1和SlHDA3去乙?；缚赡軈⑴c調(diào)

8、控果實發(fā)育和種子形成過程，且SlHDA3可能還參與調(diào)控番茄果實色素的合成與分布。
　　六、篩選部分果實發(fā)育成熟相關的轉錄因子與SlHDA1和SlHDA3進行蛋白互作分析，通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)GRAS家族的SlGRAS9和SlGRAS40兩個轉錄因子均能與兩個去乙?；赴l(fā)生互作，且鋅指蛋白家族的SlZF1可與SlHDA1互作。由此推測，SlHDA1和SlHDA3可能分別通過與相應的轉錄因子相互作用，共同調(diào)控下游基因表達，從而在番茄