番茄AGO基因的分離鑒定及SlmiR168、AGO1在番茄生長發(fā)育過程中的功能研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是植物中一類重要的調(diào)控方式，在植物發(fā)育的各個階段以及病毒防御中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miRNA是植物中內(nèi)源的一類參與到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的重要小分子，參與植物葉形態(tài)的形成、營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變以及配子的形成等生命活動。研究表明，miRNA是植物中普遍存在的一種調(diào)控手段，但是目前對于 miRNA在植物生命活動中的研究尚不夠深入。AGO蛋白是在 miRNA起作用的沉默復合體中的核心組成部分，其可以結(jié)合miRNA并在miRNA指導下

2、對靶標基因的表達進行調(diào)控。關(guān)于重要的果實模式生物——番茄中AGO基因的分布、表達以功能目前尚不明確；另外，AGO家族中的AGO1受miR168調(diào)控，但其調(diào)控機制及對番茄的生理作用未見報道。
　　因此，本研究根據(jù)擬南芥的AGO基因與番茄基因庫進行對比分析，在番茄基因組中找到15個潛在AGO基因，系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)其可根據(jù)其相似性分為三個亞家族：與擬南芥AGO1近似的AGO1亞家族、與擬南芥AGO2近似的AGO2亞家族及與擬南芥AGO4

3、近似的AGO4亞家族；對其進行組織特異性檢測發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)SlAGO基因在番茄的根、莖、葉、花以及花蕾、雄蕊、雌蕊等被檢測組織中為組成型表達，但是SlAGO5只在生殖系統(tǒng)里表達，而SlAGO4D與SlAGO7在果實發(fā)育前期表達明顯強于其它組織與時期；細胞定位分析結(jié)果表明，番茄AGO蛋白定位于細胞核與細胞質(zhì)中，但在AGO1A、AGO1B、AGO5和AGO10的細胞定位觀察中發(fā)現(xiàn)細胞核膜及細胞質(zhì)膜上存在大量熒光信號。
　　在前期生物信息

4、學分析的基礎(chǔ)上，獲得番茄 miR168序列及其靶標基因SlAGO1A及SlAGO1B的信息，然后借助超表達35S驅(qū)動的miR168以獲得miR168功能獲得的轉(zhuǎn)基因植株；采用在SlAGO1A與SlAGO1B與miR168匹配位點定點突變（4m-SlAGO1A及4m-SlAGO1B）的方法來獲得miR168-resistance轉(zhuǎn)基因植株；采用 miR168-sponge的方法獲得 miR168功能缺失的轉(zhuǎn)基因植株。通過對這三種轉(zhuǎn)基因植株

5、表型的觀察及分析表明：
　　1)在番茄中分離的15個AGO基因中，SlAGO1A及SlAGO1B兩個AGO基因受miR168調(diào)控，SlAGO1A及SlAGO1B蛋白又可促進miR168的表達和穩(wěn)定，miR168與SlAGO1A與SlAGO1B之間存在相互調(diào)控而到達平衡的關(guān)系；
　　2)在對三種轉(zhuǎn)基因的表型的觀察中發(fā)現(xiàn)，miR168可以通過影響SlAGO1s而參與到植物的生長、發(fā)育階段的轉(zhuǎn)化、成熟葉片的向上反應、果實生成、果實

6、膨脹等過程中。通過分子檢測，明確miR168可以通過SlAGO1s而影響早期在營養(yǎng)生長及轉(zhuǎn)化過程中起重要作用的miR156的累積，進而影響植株的生長速率及開花時間；miR168可以通過調(diào)控SlAGO1s而影響直接參與到乙烯通路中的miR164及潛在參與到乙烯相應中的miR172的累積而造成葉片向上反應；miR168可以通過調(diào)控SlAGO1s而影響參與生長素途徑中的miR167及miR393，并且影響潛在參與赤霉素途徑中的miR171而影

7、響果實的生成及膨大；
　　3)在三種轉(zhuǎn)基因?qū)に丶碍h(huán)境的相應過程中，發(fā)現(xiàn) miR168可以通過降低SlAGO1s的表達方式來影響種子在不同濃度ABA處理下的發(fā)芽速度以及發(fā)芽率。另外，miR168是隨光周期呈現(xiàn)節(jié)律性震蕩并且超表達miR168的轉(zhuǎn)基因植株在10μM NPA的處理下，其莖的延伸能力明顯優(yōu)于野生型，結(jié)合超表達miR168植株變高及花枝變多的表型，能接受光信號的miR168可以通過影響SlAGO1s的表達，從而影響轉(zhuǎn)基因植

8、株對生長素的相應，進而平衡花絮的發(fā)育，使得轉(zhuǎn)基因具有更多的花；
　　4)對 miR168及 SlAGO1s調(diào)控的重要的miRNA（與生長素轉(zhuǎn)運相關(guān)的miR166及與開花相關(guān)的miR172）轉(zhuǎn)基因的表現(xiàn)進行觀察及統(tǒng)計，進一步挖掘miR168影響番茄生長發(fā)育的信號通路。
　　本研究圍繞番茄生長發(fā)育過程中miR168與SlAGO1的相互調(diào)控問題，對番茄的AGO蛋白進行分離鑒定和分析，明確番茄中miR168與SlAGO1的相互作用及