蛛網(wǎng)膜下腔移植APA-NIH3T3-rPENK對大鼠神經(jīng)性疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng).pdf

1、神經(jīng)性疼痛是由神經(jīng)系統(tǒng)損傷或功能障礙所導(dǎo)致的，它是一種痛苦的神經(jīng)疾病，目前傳統(tǒng)的鎮(zhèn)痛藥尚不能有效地治療。腦啡肽作為一種內(nèi)源性阿片肽，其主要作用是通過抑制疼痛信息的傳遞來發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，經(jīng)過包裝細(xì)胞系的包裝，可將腦啡肽基因整合到靶細(xì)胞基因組中長期穩(wěn)定表達(dá)。因此，可將轉(zhuǎn)腦啡肽基因細(xì)胞移植于病人脊髓蛛網(wǎng)膜下腔，用于治療神經(jīng)性疼痛。然而潛在的宿主影響和嚴(yán)重的排異反應(yīng)是異種移植不可避免的問題，為了防止移植排異反應(yīng)，本研究應(yīng)用海藻

2、酸鈉一聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)的方法將轉(zhuǎn)腦啡肽基因NIH3T3細(xì)胞(NIH3T3/rPENK)進(jìn)行微囊化包埋以達(dá)到免疫隔離的效果，然后將APA-NTH3T3/rPENK移植入大鼠脊髓蛛網(wǎng)膜下腔，觀察APA-NIH3T3/rPENK對大鼠神經(jīng)性疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，檢測大鼠腦脊液中腦啡肽含量的變化以及脊髓背角NMDAR2B蛋白的表達(dá)強度，探討移植鎮(zhèn)痛機制，同時了解APA微囊的免疫隔離效果，為APA-NIH3T3/rPENK脊髓蛛網(wǎng)膜下腔移植

3、鎮(zhèn)痛技術(shù)的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 方法 1、囊化細(xì)胞培養(yǎng)觀察及腦啡肽分泌檢測利用高壓靜電微囊制作儀，將轉(zhuǎn)鼠腦啡肽基因NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行APA微囊化操作，混懸于含10％胎牛血清的DMEM中，37℃，5％C02的孵箱條件下培養(yǎng)，鏡下觀察囊內(nèi)細(xì)胞生長狀況，每隔1天檢測分泌到囊外的目的基因產(chǎn)物腦啡肽的濃度。 2、觀察神經(jīng)性疼痛動物模型熱痛閾變化規(guī)律20只成年雄性SD人鼠被隨機均分成2組：CCI模型組、CCI模型假手術(shù)組。CCI

4、模型組，結(jié)扎右側(cè)坐骨神經(jīng)；CCI模型假于術(shù)組，儀暴露出右側(cè)坐骨神經(jīng)，不做結(jié)扎。術(shù)后第5天開始測量左右爪熱痛閾，隔天測量1次，測量6周。 3、移植觀察鎮(zhèn)痛效應(yīng)30只成年雄性SD大鼠被隨機均分成3組：空囊組(APA組)、裸細(xì)胞組(NIH3T3/rPENK組)和微囊化細(xì)胞組(APA-NIH3T3/rPENK組)。CCI手術(shù)后第12天，APA組向大鼠蛛網(wǎng)膜下腔植入40 μl空囊懸液，約含空囊300個；NIH3T3/rPENK組向大鼠蛛網(wǎng)

5、膜下腔植入40μ lNIH3T3/rPENK懸液，約含細(xì)胞2×10<'6>個；APA-NH13T3/rPENK組向大鼠蛛網(wǎng)膜下腔植入40μlAPA-NH3T3/rPENK懸液，約含細(xì)胞2×10<'6>個。 熱痛閾測定：移植后第2天開始測量術(shù)側(cè)后爪熱痛閾，開始每天測量一次，5天后隔天測量，測量截止到移植術(shù)后21天。 拮抗劑實驗：移植術(shù)后第11天，3組大鼠分別腹腔注射阿片受體拮抗劑--納洛酮(0.08mg/kg)。觀察對止痛

6、效果的影響。 人工腦脊液灌流：用恒流輸液泵將人工腦脊液灌入大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，冰浴下收集腦脊液灌流液約1ml，沸水滅活，離心取上清，保存于-20℃待測。放射免疫法檢測腦啡肽含量。 NMDAR2B蛋白表達(dá)：移植術(shù)后第21天，應(yīng)用NMDAR2B抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色來鑒定脊髓背角NMDAR2B蛋白的表達(dá)強度。 結(jié)果 1、囊化細(xì)胞培養(yǎng)觀察：隨著培養(yǎng)時間的增加，細(xì)胞開始向周圍增殖分裂并逐漸聚集生長。到第12天時，可

7、見形成克隆狀細(xì)胞團(tuán)；囊膜對目的基因產(chǎn)物腦啡肽的通透性檢測：培養(yǎng)第3天，腦啡肽濃度為12.9±1.6pg/ml，到第11天，增加達(dá)到197.0±38.1pg/ml。隨著細(xì)胞在囊內(nèi)的逐漸擴增，分泌到囊外的腦啡肽呈現(xiàn)出明顯增加趨勢。 2、神經(jīng)性疼痛動物模型熱痛閾變化規(guī)律：CCI術(shù)后5天，坐骨神經(jīng)結(jié)扎側(cè)熱痛閾低于對照側(cè)，但差異不明顯(p>0.05)：CCI術(shù)后7天坐骨神經(jīng)結(jié)扎側(cè)熱痛閾和對照側(cè)相比，差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)

8、；CCI術(shù)后7～33天，結(jié)扎側(cè)和對照側(cè)熱痛閾差異均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05或p<0.01)：CCI術(shù)5周以后，結(jié)扎側(cè)熱癰閾逐漸升高，和對照側(cè)相比，差異均不明顯(p>0.05)。假手術(shù)組，各天左右爪熱痛閾差異均不明顯(P>0.05)。 3、移植術(shù)后熱痛閾測定：．APA組移植前后熱痛閡未見明顯變化；與APA組相比，接受NIH3T3/rPENK移植組在移植后3～21天，接受APA-NIH3T3/rPENK移植組在移植后5～2l天，熱

9、痛悶都明顯高于APA組(p>0.01或p<0.05)；與APA-NIH3T3/rPENK組相比，兩周以后，接受NIH3T3/RPENK移植組熱痛閾明顯低于APA-Nitt3T3/rPENK組(P<0.05)。說明NIH3T3/rPENK植入大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔對大鼠的神經(jīng)性疼痛有鎮(zhèn)痛作用，且這種作用隨時問而減弱。．APA微囊具有良好的免疫隔離作用，包裹以后能延長NIH3T3/rPENK細(xì)胞的鎮(zhèn)痛時間，提高移植兩周以后的鎮(zhèn)痛效果。 4

10、、拮抗劑試驗：移植術(shù)后第11天，3組大鼠分別腹腔注射阿片受體拮抗劑--納絡(luò)酮，APA組注射前后熱痛閾比較差異不明顯(p>0.05)：NIH3T3/RPENK和APA-NIH3T3/rPENK組，與注射前比較，注射后熱痛閾明顯降低(p<0.01)，鎮(zhèn)痛效應(yīng)被納洛酮翻轉(zhuǎn)。 5、腦脊液灌流液中腦啡肽的含量：移植21d后，APA組腦脊液灌流液中亮氨酸腦啡肽(leucine-enkephalin,L-EK)含量顯著低于NIH3T3/rPE

11、NK組和APA-NIH3T3/rPENK組(p<0.01)：NIH3T3/rPENK組腦脊液灌流液中L-EK含量顯著低于APA-NIH3T3/rPENK組(P<0.01)。說明大鼠蛛網(wǎng)膜下腔移植NIH3T3/rPENK可以提高腦脊液灌流液中腦啡肽的含量，APA微囊包裹可延長升高的時間。 6、NMDAR2B蛋白表達(dá)：移植21天后，APA組大鼠結(jié)扎側(cè)脊髓背角NMDAR2B陽性蛋白積分光密度明顯高于NIH3T3/rPENK、．APA-

12、NIH3T3/rPENK和正常對照組(p<0.01)； NIH3T3/rPENK組明顯高于APA-NIH3T3/rPENK和正常對照組(P<3.05)；而APA-NIH3T3/rPENK和正常對照組未見明顯差異(p>0.05)。說明移植3周后，NIH3T3/rPENK移植能抑制神經(jīng)性疼痛大鼠脊髓背角NMDAR2B蛋白表達(dá)，且APA微囊包裹后效果更好。 結(jié)論；NIH3T3/RPENK或APA-NIH3T3/rPENK植入大鼠的蛛網(wǎng)