經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植神經(jīng)祖細(xì)胞治療脊髓頓挫傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs）培養(yǎng)方法及傳10代培養(yǎng)后的細(xì)胞特點(diǎn)，同時(shí)觀察有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后活體外NPCs的分化情況。將未分化NPCs行不同時(shí)間（急性期、亞急性期及慢性期）經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植神經(jīng)祖細(xì)胞治療脊髓頓挫傷的效果，尋找該途徑NPCs移植的最佳時(shí)機(jī)，為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　方法：采用撿栓法確定綠色熒光轉(zhuǎn)基因大鼠懷孕時(shí)間為14±0.5d，取胚胎轉(zhuǎn)基因鼠腦泡，消化為單個(gè)細(xì)胞后置入包被了層粘連蛋白的培養(yǎng)瓶中，用干細(xì)胞培養(yǎng)基培

2、養(yǎng)，每3~5d傳代，共傳10代（P10）備用。P10細(xì)胞爬片后分別用nestin,A2B5,NeuN,GFAP,NF及O4染色，觀察神經(jīng)標(biāo)記物的表達(dá)情況，并做細(xì)胞活性鑒定。136只成年雌性大鼠，體重250–300g，用ImpactorII（NYU）建立脊髓頓挫傷大鼠模型，隨機(jī)分為為7組：急性期細(xì)胞移植組（A),亞急性期細(xì)胞移植組(S),慢性期細(xì)胞移植組（C),每組均設(shè)培養(yǎng)基對(duì)照組(MA,MS,MC)及空白對(duì)照組(N)。取P10代NPCs

3、，按照上述分組于損傷即刻、損傷后7d及損傷后4周經(jīng)腰穿將NPCs移植入大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，每組隨機(jī)取3只于細(xì)胞移植后1周、2周、4周、8周及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)取材觀察椎管內(nèi)細(xì)胞存活及遷移情況，于并于模型建立后每組隨機(jī)取10只行BBB評(píng)分至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，所得數(shù)據(jù)采用Spss軟件分析，進(jìn)行重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：在無(wú)分化培養(yǎng)基中，NPCs表現(xiàn)為小圓形祖細(xì)胞狀態(tài)。移植前NPCs表達(dá)A2B5和Nestin，不表達(dá)NeuN、G

4、FAP及O4。有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后少量細(xì)胞可分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元少見(jiàn)。A組在細(xì)胞移植后4周可以觀察到移植細(xì)胞遷移入損傷區(qū)脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)，移植的NPCs沿著組織間隙向損傷區(qū)脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)遷移，尤其是白質(zhì)纖維間隙遷移，損傷區(qū)吻側(cè)及尾側(cè)軟腦膜與硬脊膜上均可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)附著，尤其在馬尾區(qū)細(xì)胞團(tuán)較多，但是A組在8周及終末取材時(shí)（12周）未能見(jiàn)到存活的綠色熒光細(xì)胞。S組大鼠在細(xì)胞移植4周內(nèi)均可見(jiàn)到移植的NPCs，但未見(jiàn)到移植細(xì)胞侵入損傷區(qū)

5、或完整脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)，但S組在細(xì)胞移植后8周及終末取材時(shí)未能見(jiàn)到存活的綠色熒光細(xì)胞。C組在細(xì)胞移植后8周內(nèi)均可見(jiàn)移植的NPCs團(tuán)附著于軟腦膜或硬脊膜上，以馬尾區(qū)細(xì)胞團(tuán)附著較多，而損傷區(qū)吻側(cè)細(xì)胞附著較少，未見(jiàn)到移植的NPCs向脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)遷移，但馬尾區(qū)細(xì)胞團(tuán)內(nèi)部分細(xì)胞可表達(dá)GFAP及O4。對(duì)照組均未見(jiàn)到移植的NPCs。各組其他腦組織中如海馬、紋狀體及側(cè)腦室中均未見(jiàn)到移植的細(xì)胞，也沒(méi)有移植的NPCs遷移入腦實(shí)質(zhì)現(xiàn)象。A組在細(xì)胞移植后2周~12周時(shí)

6、BBB評(píng)分比S組、C組及N組有明顯提高(P＜0.01)。SCI建模4周~12周S組、C組及N組間比較差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)；細(xì)胞移植后4周為時(shí)間點(diǎn)，A組BBB評(píng)分均高于S組、C組及N組，差異有顯著性(P＜0.01)，但S組與C組及N組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)間比較，BBB評(píng)分無(wú)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：神經(jīng)祖細(xì)胞體外培養(yǎng)傳代至少可傳代10次以上；通過(guò)蛛網(wǎng)膜下腔進(jìn)行NPCs移植治療脊髓損傷需要考慮時(shí)間窗的問(wèn)題，急性期進(jìn)行細(xì)胞移植，