撤鉀誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)calpain切割GSK-3β的研究.pdf

1、神經(jīng)元凋亡引起的神經(jīng)元丟失是神經(jīng)退行性疾病如帕金森病和老年性癡呆癥的重要病理特征。闡明對(duì)神經(jīng)元凋亡起關(guān)鍵性作用的蛋白質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)控機(jī)制，對(duì)揭示神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的本質(zhì)并尋找、確立藥物靶點(diǎn)，從而進(jìn)一步達(dá)到有效防治神經(jīng)退行性疾病的目的，具有重要意義。 小腦顆粒神經(jīng)元(cerebellar granule neurons，CGNs)是哺乳動(dòng)物腦中豐富的中樞神經(jīng)元。體外培養(yǎng)CGNs時(shí)，去極化濃度的KCl(25mmol/L，25K)

2、可以維持小腦顆粒神經(jīng)元的存活分化、和成熟，而復(fù)極化濃度的KCl(5mmo/L，5K)培養(yǎng)基可誘導(dǎo)分化成熟的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。由于小腦顆粒神經(jīng)元來源豐富、體外培養(yǎng)的同質(zhì)性高，所以此凋亡模型已被廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)元凋亡機(jī)制的研究。 GSK-3β(glycogen synthase kinase-3β)是神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵性激酶，是多種促神經(jīng)元存活信號(hào)干預(yù)神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵性靶位。目前，多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道GSK-3β活性主要受自身N-末端磷酸

3、化水平的調(diào)控，Ser9磷酸化的N-末端具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制GSK-3β活性的作用。最近，我們觀察到，小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)，GSK-3β除了出現(xiàn)Ser9磷酸化水平降低之外，還發(fā)生了蛋白切割，而蛋白切割是神經(jīng)元凋亡時(shí)的一種重要調(diào)控機(jī)制。這些觀察提示，GSK-3β不僅通過Ser9去磷酸化，而且還可能通過蛋白切割這一方式來調(diào)控神經(jīng)元的凋亡。 因此,本課題主要研究以下內(nèi)容: 1、GSK-3β是否為撤鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡所必需?

4、 2、什么蛋白酶介導(dǎo)了GSK-3β的切割? 3、GAK-3β的切割發(fā)生在哪一端? 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果： 一、GSK-3β為撤鉀誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡所必需 1.抑制GSK-3β對(duì)撤鉀誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡具有保護(hù)性干預(yù)作用。 為了觀察GSK-3β是否促神經(jīng)元凋亡，我們首先采用了抑制劑實(shí)驗(yàn)。小腦顆粒神經(jīng)元體外培養(yǎng)第7天，分別給予25K、5K、5K+SB415286(50μM)、5K+AR-A0144

5、28(10μM)、5K+CT99021(0.4μM)等處理。12小時(shí)后，加入Hoechst33258(5μg/ml)進(jìn)行活細(xì)胞染色以觀察核形態(tài)，倒置熒光顯微鏡(200×)觀察并拍照計(jì)算凋亡率。結(jié)果表明GSK-3抑制劑可以保護(hù)性干預(yù)神經(jīng)元凋亡。 為排除抑制劑的非特異作用，我們采用GSK-3β的負(fù)顯性質(zhì)粒K85R來抑制GSK-3β的活性。將K85R和GFP共轉(zhuǎn)染神經(jīng)元，36小時(shí)之后，換成25 K、5 K培養(yǎng)基處理12小時(shí)，Hoech

6、st 33258染色，計(jì)算GFP標(biāo)記的神經(jīng)元凋亡率。結(jié)果表明：K85R能夠有效地保護(hù)神經(jīng)元。 為了排除以上2種方法對(duì)GSK-3α的非特異作用，我們構(gòu)建了GSK-3β小分子干擾片段shGSK-3β-a、shGSK-3-b特異有效地干擾神經(jīng)元內(nèi)源性GSK-3β的表達(dá)。將這些小分子干擾片段轉(zhuǎn)染神經(jīng)元，48小時(shí)之后，換成25K、5K培養(yǎng)基處理12小時(shí)，Hoechst 33258染色，計(jì)算GFP標(biāo)記的神經(jīng)元凋亡率。結(jié)果顯示小分子干擾片段s

7、hGSK-3β-a、shGSK-3β-b能夠明顯地降低神經(jīng)元的凋亡率。 以上分別通過抑制劑、負(fù)顯性和小分子干擾的方法逐層遞進(jìn)地闡明：抑制GSK-3β可以保護(hù)神經(jīng)元。 2.組成性激活的GSK-3β誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。 為了從另一個(gè)角度觀察GSK-3β對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響，我們進(jìn)一步觀察了GSK-3β的組成性激活質(zhì)粒S9A對(duì)神經(jīng)元的作用。體外培養(yǎng)第5天的小腦顆粒神經(jīng)元，用鈣磷沉淀法共轉(zhuǎn)染pCMV-EGFP與pcDN

8、A3.1或pcDNA3.1-GSK-3β—S9A—V5質(zhì)粒(簡(jiǎn)稱為S9A)。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)36小時(shí)，換25K、5K模型。12小時(shí)后，Hoechst 33258進(jìn)行核染色，倒置熒光顯微鏡(200×)觀察并拍照計(jì)算凋亡率。結(jié)果顯示組成性激活的GSK3β可以誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。 上述結(jié)果強(qiáng)烈支持GSK-3B是小腦顆粒神經(jīng)元凋亡所必需，那它參與神經(jīng)元凋亡調(diào)控的機(jī)制是什么呢? 二、神經(jīng)元凋亡時(shí)calpain切割GSK-3β

9、1.GSK-3β在小腦顆粒神經(jīng)元凋亡過程中被切割。 為了闡明GSK-3β調(diào)控神經(jīng)元凋亡的機(jī)制，我們首先觀察了神經(jīng)元凋亡過程中GSK-3β蛋白表達(dá)水平的變化。小腦顆粒神經(jīng)元體外培養(yǎng)第7天，分別給予25K、5K處理4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)和16小時(shí)后，收集細(xì)胞總蛋白，在8％的SDS-PAGE凝膠內(nèi)進(jìn)行分離；使用識(shí)別GSK-3β中間區(qū)域(345—420aa)的抗體進(jìn)行Western Blot檢驗(yàn)，可見隨凋亡誘導(dǎo)時(shí)間增加，GSK-3β逐

10、漸被切割，產(chǎn)生3種可被抗體識(shí)別的產(chǎn)物：t-GSK-3β(Truncated GSK-3)1，2,3。結(jié)果表明GSK-3β在小腦顆粒神經(jīng)元凋亡過程中被切割。 2.Calpain介導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)GSK-3β的切割。 為了明確何種蛋白酶介導(dǎo)了GSK-3β的切割，我們觀察了不同蛋白酶抑制劑對(duì)GSK-3β切割的抑制效果。小腦顆粒神經(jīng)元體外培養(yǎng)第7天，分別給予25K、5K、5K+25 gM ALLM(calpain抑制劑)、

11、5K+10 μM Z-VAD(caspase抑制劑)處理16小時(shí)后，收集細(xì)胞總蛋白，在8-12％的SDS-PAGE凝膠內(nèi)進(jìn)行分離；使用識(shí)別GSK-3β中間區(qū)域(345-420 aa)和caspase-3的抗體進(jìn)行Western Blot檢驗(yàn)，可見小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)GSK-3β被切割，產(chǎn)生3種可被抗體識(shí)別的產(chǎn)物，calpain的抑制劑ALLM能較好地抑制GSK-3β的切割現(xiàn)象，caspase抑制劑Z-VAD有效地抑制了caspase-3

12、的激活但卻不能抑制GSK-3β的切割。結(jié)果提示，calpain介導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)GSK-3β的切割。 3.GSK-3β的N-末端和C-末端都被calpain切割。 為了闡明GSK-3β的切割產(chǎn)物對(duì)凋亡可能產(chǎn)生的作用，我們首先觀察GSK-3β的切割發(fā)生在哪一端。小腦顆粒神經(jīng)元體外培養(yǎng)第7天，分別給予25K、5K、5K+25μMALLM(calpain抑制劑)處理16小時(shí)后，收集細(xì)胞總蛋白，在8％的SDS-PAGE凝

13、膠內(nèi)進(jìn)行分離；分別使用識(shí)別GSK-3β中間區(qū)域(345—420 aa)、C-末端的抗體(403—420aa)的抗體進(jìn)行Western Blot檢驗(yàn)。我們可以觀察到識(shí)別GSK-313中間區(qū)域的抗體可以識(shí)別到3種切割產(chǎn)物(tGSK-3β 1,2，3)，而識(shí)別GSK-3β C-末端的抗體只能識(shí)別到一種切割產(chǎn)物(tGSK-3β 1)。以上結(jié)果表明小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)GSK-3p的切割產(chǎn)物中既有缺少N-末端的GSK-3β(簡(jiǎn)稱為△N-GSK-3p

14、)，也有缺少C-末端的GSK-3β(簡(jiǎn)稱△C—GSK-3β)，還可能有N-末端和C-末端都被切割的GSK-313(簡(jiǎn)稱為△N/C—GSK-3β)，說明GSK-3β的N-末端和C-末端都被calpain所切割。此外，我們還分別對(duì)重組純蛋白His—GSK-3β和免疫沉淀293細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的GSK-3β-V5產(chǎn)物進(jìn)行體外calpain酶切實(shí)驗(yàn)。酶切結(jié)果和神經(jīng)元內(nèi)現(xiàn)象一致，結(jié)果表明calpain可以直接切割GSK-3β,切割位點(diǎn)既發(fā)生在N-末端