聯(lián)合應(yīng)用ROCKⅡ及GSK-3β抑制劑對缺氧缺血腦損傷新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞骨架穩(wěn)定作用研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)以新生SD（Sprague Dawley）大鼠為研究對象，觀察分別應(yīng)用Rho-GTP酶（ROCKII）抑制劑法舒地爾（Fasudil）、GSK-3β激酶抑制劑TDZD8以及兩者聯(lián)合應(yīng)用對缺氧缺血腦損傷（Hypoxic Ischemic Brain Damage，HIBD）大鼠腦海馬組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、肌動蛋白相關(guān)通路（Rho/ROCK信號通路）以及微管蛋白相關(guān)通路（PI3K/AKT/GSK-3β信號通路）中重要蛋白

2、表達(dá)水平的變化，以及對細(xì)胞凋亡的影響，探討同時(shí)抑制影響軸突生長的兩個(gè)關(guān)鍵酶ROCKII和GSK-3β激酶，能否使肌動蛋白F-actin及微管蛋白β-tublin降解破壞減少，了解聯(lián)合用藥的神經(jīng)保護(hù)作用，為臨床上開發(fā)聯(lián)合用藥治療新生兒缺氧缺血性腦病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料與方法：
　　采用出生7天SD大鼠，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、HIBD組、溶劑組、Fasudil組、TDZD8組、聯(lián)合用藥組。參照Rice方法制作HIBD模型

3、；Fasudil組、TDZD8組、聯(lián)合用藥組及溶劑組大鼠在制作HIBD模型后0h、24h、48h各腹腔給藥或生理鹽水（NS，normal saline）一次，72h處死，取大鼠腦海馬組織，HE染色觀察組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；Western Blot檢測海馬組織ROCKII、F-actin、p-GSK-3β、β-tubulin蛋白表達(dá)量；TUNEL染色檢測海馬組織細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS for Windows21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行資

4、料分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?s_）表示，采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差為齊性，組間兩兩比較以Scheffe方法分析；若方差不齊，以Dunnett T3方法分析。P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.HE染色觀察各組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)
　　正常組及假手術(shù)組細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰、排列有序，組織細(xì)胞間隙正常，細(xì)胞核清晰可見，胞漿染色均勻

5、。HIBD組及溶劑組細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，可見細(xì)胞胞體腫脹呈氣球樣變，神經(jīng)元數(shù)目減少，部分區(qū)域可見細(xì)胞核固縮等壞死性改變及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生。Fasudil及TDZD8干預(yù)組細(xì)胞形態(tài)有所改善，但密度仍較正常組減低，少部分區(qū)域可見細(xì)胞出現(xiàn)皺縮改變。聯(lián)合用藥組細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)基本完整，大部分細(xì)胞核清晰可見，神經(jīng)細(xì)胞的壞死及變性程度較HIBD組明顯減輕。
　　2.TUNLE染色檢測各組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況
　　正常組、假手術(shù)組、HIBD組、

6、溶劑組、Fasudil組、TDZD8組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率分別為：9.27±1.48，12.31±1.65，65.14±3.74，68.79±3.26，47.31±2.95，45.58±2.42，14.27±1.51（P<0.05）；Fasudil組及TDZD8組均較HIBD組相比細(xì)胞凋亡減少（P<0.05），但仍低于正常組（P<0.05），而聯(lián)合用藥組能較顯著改善細(xì)胞凋亡情況，與正常組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　

7、　3.Western Blot方法檢測肌動蛋白、微管蛋白及其上游蛋白表達(dá)情況
　　HIBD組海馬組織F-actin及β-tubulin蛋白量均明顯低于正常組（P<0.05）；分別給予藥物Fasudil或TDZD8干預(yù)后，細(xì)胞骨架蛋白降解減少，F(xiàn)-actin及β-tubulin蛋白表達(dá)有所增加，其中，β-tubulin蛋白表達(dá)與HIBD組相比有差異（P<0.05）,而F-actin與HIBD組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；聯(lián)合用

8、藥組F-actin及β-tubulin蛋白表達(dá)較分別給藥時(shí)增加更明顯，與HIBD組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，HIBD組ROCKII蛋白表達(dá)明顯高于正常組（ P<0.05）， p-GSK-3β蛋白表達(dá)明顯低于正常組（ P<0.05），推測Rho/ROCK及AKT/GSK-3β兩條信號通路參與細(xì)胞骨架降解過程，同時(shí)使用兩條通路的抑制劑可通過減少細(xì)胞骨架蛋白的降解，穩(wěn)定神經(jīng)元細(xì)胞骨架，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　結(jié)論：