用siRNA沉默c-jun對(duì)小腦顆粒神經(jīng)元的保護(hù)作用.pdf

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文用siRNA沉默c-jun對(duì)小腦顆粒神經(jīng)元的保護(hù)作用姓名：李丹申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：藥理學(xué)指導(dǎo)教師：黎明濤20070528中山大學(xué)碩士論文 用s i R N A 沉默c - j u n 對(duì)小腦顆粒神經(jīng)元的保護(hù)作用體外培養(yǎng)7 天的小腦顆粒神經(jīng)元，從含去極化濃度鉀離子( 2 5 m m o l ／L K C l ，2 5 K ) 的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移至低鉀培養(yǎng)基( 5 m m o l ／LK C l ，5 K ) 中誘導(dǎo)凋亡

2、。利用W e s t e r nb l o t 檢測(cè)磷酸化J N K 、磷酸化c ．J u n 和c ．J u n 的水平；利用R T - P C R 檢測(cè)c - j u nm R N A 水平；利用報(bào)道基因檢測(cè)c - j u n p r o m o t e r 活性。結(jié)果顯示：撤鉀誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)，J N K 、c ．J u n 磷酸化水平增加；用J N K 抑制劑S P 6 0 0 1 2 5( 1 0 p ．m o l ／

3、L ) 和M L K 抑制劑C E P l l 0 0 4 ( 2 “m o l ／L ) ，能夠抑制c ．J u n 的磷酸化；并且撤鉀時(shí)，c - j u n 的m R N A 水平、蛋白水平、p r o m o t e r 活性都升高。以上結(jié)果表明：撤鉀誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)，J N K 、c ．J u n 活性增強(qiáng)，并且c ．J u n 活性增強(qiáng)是由J N K 介導(dǎo)的；撤鉀時(shí)，c - j u n 基因的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，c - j u

4、n 的m R N A 水平和蛋白水平都升高。2 ．J N K ／c ．J u n 是神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵通路用．I N K 抑帶0 齊0S P 6 0 0 1 2 5 ( 1 0 “m o l ／L ) 、M L K 抑帶0 齊U C E P l 1 0 0 4 ( 2 u m o l ／L )抑制J N K 活性，及用c - j u n 負(fù)顯性腺病毒A d ．A 1 6 9 抑制c ．J u n 活性，H o e c h s t 3 3

5、2 5 8進(jìn)行核染色統(tǒng)計(jì)凋亡率，觀察對(duì)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的影響。結(jié)果顯示：S P 6 0 0 1 2 5 、C E P l l 0 0 4 和A d ．A 1 6 9 都能夠保護(hù)性抑制撤鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。以上結(jié)果表明：J N K ／c ．J u n 是神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵通路。3 ． c - j u n s i R N A 保護(hù)小腦顆粒神經(jīng)元運(yùn)用小分子干擾的設(shè)計(jì)軟件及其原則，設(shè)計(jì)干擾序列，通過B L A S T ，目的干擾序列與其

6、他基因沒有顯著的同源性，并將合成的具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸鏈克隆到B S ／U 6 載體；然后將s h c - j u n 同大鼠源的c - j u n 表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染2 9 3 細(xì)胞，W e s t e r n B l o t 檢測(cè)對(duì)外源性c - j u n 的干擾有效性，將s h c - j u n 同D - g a l用鈣磷沉淀的方法共轉(zhuǎn)染小腦顆粒神經(jīng)元，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)對(duì)內(nèi)源性c - j u n 的干擾有效性；將

7、干擾質(zhì)粒同G F P 質(zhì)粒用鈣磷沉淀的方法共轉(zhuǎn)染小腦顆粒神經(jīng)元，H o e c h s t 3 3 2 5 8 進(jìn)行核染色，統(tǒng)計(jì)干擾質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示：測(cè)序表明成功構(gòu)建了s h c - j u n 質(zhì)粒；s h c - j u n 能夠有效干擾外源性和內(nèi)源性的c - j u n ；干擾掉內(nèi)源性c - j u n 可以保護(hù)性干預(yù)撤鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。以上結(jié)果表明：c - j u n s i R N A 可以保護(hù)小腦