CD137在內皮細胞的表達及功能研究.pdf

1、血管內皮細胞(Endothelialcell，EC)的免疫功能日益受到重視，內皮細胞除了保證血管壁結構與功能完整，激活后還可表達或上調表達多種免疫功能相關分子，既可作為細胞因子、炎性因子作用的靶細胞，又能分泌細胞因子等活性介質，在機體的炎癥反應和免疫應答過程中有重要作用。它具有多種免疫功能，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切的關系。 EC以MHC-Ⅱ類分子限制性方式將抗原肽呈遞給淋巴細胞，并可通過B7/CD28、CD40/CD40L、

2、CD58(LFA-3)/CD2(LFA-2)等途徑向淋巴細胞提供共刺激信號，促進免疫應答的進程。EC上表達的共刺激分子(LFA-3、CD40L、PDL-1、PDL-2、ICOSL、OX40L)和T細胞上表達的相應的受體結合后，一方面可以作用于EC而促使其活化和分泌細胞因子，另一方面又可以影響CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞活化和功能，從而參與特異性免疫應答的調控以及增強細胞因子的分泌。所以，共刺激分子在EC與T細胞的相互作用中發(fā)揮

3、著重要的作用。 研究發(fā)現(xiàn)，共刺激分子在免疫應答的不同階段介導免疫應答的啟動、激發(fā)、擴大和增強作用以及效應介導，而且通過負性共刺激分子可精確地調節(jié)應答的程度和持續(xù)的時間。效應性CD8+和CD4+T細胞的維持和功能，以及記憶性T細胞發(fā)生再次應答不依賴B7-1/B7-2-CD28/CTLA-4和CD40-CD40L共刺激信號通路，針對調節(jié)記憶和效應性T細胞的功能達到維持外周耐受應選擇ICOS-B7RP-1和PD-1-PD-L1/PD-

4、L2信號通路，但是，有時ICOS-B7RP-1或PD-1-PD-L1/PD-L2信號通路不能完全抑制CD8+T細胞的功能，而CD137在調節(jié)CD8+T細胞的功能方面有著重要的作用。 我們初步研究證實，內皮細胞在未活化時有較低的CD137蛋白表達，內皮細胞活化后CD137的表達上調。CD137是腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族的成員之一，它表達于活化的T細胞表面，介導的協(xié)同刺激信號能促進T細胞活化、增殖、分化，也能誘導T細胞凋亡。

5、CD137既能協(xié)同CD28對T細胞的共刺激作用，也能不依賴于CD28而發(fā)揮共刺激效應。另外，CD137也表達于DC和單核細胞，并促進DC和單核細胞活化及分泌細胞因子。所以，我們設想CD137在內皮細胞上表達可能同樣具有促其擴增及分泌的功能。 內皮細胞表面的CD137分子可能作為膜受體，當與相應的配體或抗體相互作用時，可介導細胞活化信號，促進其細胞因子的產(chǎn)生和分泌，參與炎癥和免疫調節(jié)。由于CD137配體(CD137L)可以在活化的

6、T細胞上表達，未活化或被LPS或其它介質活化后的內皮細胞，是否可以通過CD137/CD137L介導其與T細胞間的作用，從而對T細胞的特異性免疫應答發(fā)揮調節(jié)作用，這是我們需要進一步深入研究的問題。國內外均未見報導。為此，我們對CD137內皮細胞上的表達和功能以及在內皮細胞與T細胞相互作用中的意義進行了初步研究。本文研究的主要內容及結果包括： 1.成功的建立了人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)分離、培養(yǎng)的細胞模型，獲得了傳代穩(wěn)定，具有足

7、夠純度和數(shù)量的原代臍靜脈內皮細胞模型，保證了后續(xù)實驗的順利實施。 2.采用RT-PCR、及流式細胞分析技術，較全面地研究了未刺激和不同細胞因子束激(TNF-α(25ng/ml)、LPS(100ng/ml)、IFN-γ(1000U/ml)、IL-1β(10ng/ml)、IL-1β+IFN-γ)活化人臍靜脈內皮細胞上CD137分子的表達情況。并在24、48、48-72不同時間點檢測了CD137分子的表達情況。從mRNA和蛋白水平證實

8、HUVEC能組成性表達CD137分子，用IL-1β+IFN-γ協(xié)同刺激48-72h后，CD137分子表達明顯升高，但是CD137L分子無論刺激與否都不表達。 3.應用激發(fā)型anti-CD137單克隆抗體交聯(lián)內皮細胞上的CD137分子，CD137和抗體交聯(lián)后向細胞內傳遞活化信號，成功地刺激了內皮細胞的活化，誘導內皮細胞合成和分泌細胞因子IL-1、IL-8及粘附分子ICAM-1。說明CD137向內皮細胞內傳遞活化信號，誘導內皮細胞活

9、化。 4.應用PHA和IL-2協(xié)同刺激T細胞，誘導了T細胞活化，驗證了CD137L在活化T細胞表面的表達，為下一步的功能研究提供了實驗依據(jù)。采用共培養(yǎng)技術，模擬體內內皮細胞與T細胞的相互作用，首次應用活化的T細胞刺激了內皮細胞活化，誘導了內皮細胞合成和分泌細胞因子IL-1、IL-8以及粘附分子ICAM-1的表達。當應用可溶性融合蛋白CD137-Fc阻斷后，內皮細胞合成和分泌細胞因子的能力降低。說明CD137-Fc成功地阻斷了CD

10、137/CD137L的相互作用，證明活化的T細胞通過表達的CD137L結合內皮細胞上表達的CD137，刺激了內皮細胞的活化。 5.采用細胞共培養(yǎng)，首次證明了活化的內皮細胞誘導表達CD137蛋白分子與活化的T細胞上誘導表達的CD137L相互作用，通過CD137L向T細胞內傳遞抑制信號，抑制了T細胞合成和分泌細胞因子的功能，T細胞分泌IL-2、IL-10和IFN-γ的水平下降。應用anti-CD137單克隆抗體阻斷CD137/CD1

11、37L相互作用后，阻斷了CD137L介導的抑制作用，IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌水平升高。同時，應用CCK-8試劑盒檢測共培養(yǎng)后的T細胞的存活率并進行統(tǒng)計學分析，結果顯示，T細胞的存活率下降，說明CD137L反向信號傳導介導了凋亡信號，表明CD137/CD137L信號通路在內皮細胞與T細胞的信號作用中有著重要的地位。 綜上，本研究在證實CD137分子在內皮細胞上的表達以及活化T細胞誘導表達CD137L的基礎上，首次應用