乏氧及CD137通路對DC功能的影響.pdf

1、第一篇乏氧及CD137通路對DC功能的影響
　　 目的：
　　 本課題在研究乏氧、再氧合對小鼠DC功能影響的基礎(chǔ)上，進一步探討了CD137通路對乏氧DC功能的影響，以期通過CD137通路增強乏氧DC的功能，進而增強固有免疫應(yīng)答或適應(yīng)性免疫應(yīng)答，從而為腫瘤以及移植排斥等的免疫治療提供新的思路和方法。
　　 方法：
　　 一、常、乏氧條件下DC的表型及功能變化
　　 1.分離C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞

2、，分別在常、乏氧條件下利用GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)未成熟DC，LPS刺激DC成熟。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測常、乏氧條件下分化DC表面的協(xié)同刺激分子CD80，CD86及MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)差異。
　　 3.RT-PCR和ELISA法分別檢測常、乏氧條件下分化DC所分泌細(xì)胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α，TGF-β以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9的表達(dá)差異。
　　 4.CFSE法檢測常、乏氧條件下分化DC刺激C

3、D4+T細(xì)胞增殖能力的差異。
　　 二、再氧合對乏氧條件下DC表型及功能的影響
　　 1.對乏氧條件下分化的DC進行不同時間的再氧合。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測再氧合DC的表型變化。
　　 3.CFSE方法檢測再氧合DC刺激CD4+T細(xì)胞增殖能力的變化。
　　 5.流式細(xì)胞術(shù)檢測再氧合DC刺激CD4+T細(xì)胞向IFN-γ+Thl，IL-4+Th2細(xì)胞的分化。
　　 5.ELISA方法檢測再氧

4、合DC刺激CD4+T細(xì)胞增殖體系中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的表達(dá)水平。
　　 三、CD137通路對乏氧條件下分化DC表型及功能的影響
　　 1.以抗CD137單克隆抗體刺激乏氧條件下分化的DC。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測抗CD137單抗刺激DC的表型變化。
　　 3.RT-PCR法檢測抗CD137單抗刺激DC所分泌細(xì)胞因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9的表達(dá)變化。
　　 4.CFSE法檢測抗CD1

5、37單抗刺激DC刺激CD4+T細(xì)胞增殖能力的變化。
　　 結(jié)果：
　　 一、乏氧對DC表型及功能的影響
　　 1.骨髓來源DC的誘導(dǎo)和純度
　　 自2.乏氧抑制DC的表型成熟
　　 3.乏氧抑制DC炎性細(xì)胞因子IL-1，IL-6和TNF-α的分泌以及MMP9的產(chǎn)生，上調(diào)免疫抑制因子TGF-β的分泌
　　 4.乏氧抑制DC刺激同種異型CD4+T細(xì)胞增殖的能力
　　 二、再氧合對乏氧D

6、C表型及功能的影響
　　 1.再氧合促進乏氧DC的表型成熟
　　 2.再氧合增強DC刺激CD4+T細(xì)胞增殖的能力
　　 3.再氧合DC誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Thl細(xì)胞分化
　　 三、CO137通路對乏氧DC表型及功能的影響
　　 1.CD137單抗上調(diào)乏氧DC的成熟表型
　　 .CID137單抗可促進乏氧DC炎性細(xì)胞因子及MMP9的產(chǎn)生
　　 3.CD137單抗對乏氧DC刺激CD4+

7、T細(xì)胞增殖能力的影響
　　 由于CD137單抗可在一定程度上刺激乏氧DC的表型成熟，我們進一步研究了CD137單抗對乏氧DC刺激CD4+T細(xì)胞增殖能力的影響。我們用來自C57BI/6小鼠的CD137單抗刺激的乏氧DC作為刺激細(xì)胞，用來自BALB/c小鼠的CD4+T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，進行T細(xì)胞增殖實驗，結(jié)果顯示CD137單抗刺激的乏氧DC其誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞增殖率略高于無CD137單抗作用的乏氧DC，但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義。提示CD1

8、37通路對乏氧DC誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞增殖的能力無明顯影響。
　　 結(jié)論：
　　 一、乏氧抑制LPS誘導(dǎo)的DC成熟及功能
　　 1.乏氧可抑制LPS誘導(dǎo)的DC的成熟表型。
　　 2.乏氧可降低DC分泌炎性細(xì)胞因子IL-1，IL-6和TNF-α，增高免疫抑制因子TGF-β的表達(dá)。
　　 3.乏氧可抑制DC刺激CD4+T細(xì)胞增殖的能力。
　　 二、再氧合促進乏氧DC的成熟及功能
　　 1

9、.再氧合顯著促進乏氧DC的表型成熟。
　　 2.再氧合顯著增強乏氧DC刺激CD4+T細(xì)胞增殖的能力。
　　 3.再氧合DC誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化。
　　 三、CD137通路可促進乏氧DC的成熟及其功能
　　 1.CD137單抗可上調(diào)乏氧DC的成熟表型。
　　 2.CD137單抗可促進乏氧DC分泌炎性細(xì)胞因子IL-1，IL-6，IL-12和TNF-α。
　　 3.CD137單抗對

10、乏氧DC誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞增殖的能力無明顯影響。
　　 二篇cD137和cD137L在人原發(fā)腫瘤組織中的表達(dá)及意義
　　 目的：
　　 CD137作為腫瘤壞死因子超家族的一員，主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表面；其配體CD137L主要表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞表面，如成熟的樹突狀細(xì)胞(dendritic ce1ls，DC)，活化的B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。CDl37-CD137L介導(dǎo)的共刺激信號可增強T細(xì)胞活化，促進心臟同

11、種異型移植物的排斥反應(yīng)，清除實驗誘導(dǎo)的小鼠腫瘤。
　　 然而，人類CD137和CD137L的表達(dá)并不局限于免疫細(xì)胞，人CD137-CD137L通路的功能也遠(yuǎn)比小鼠復(fù)雜。CD137蛋白已被證明可表達(dá)于原發(fā)惡性腫瘤的血管壁；CD137L亦被發(fā)現(xiàn)可表達(dá)于幾種不同的人類腫瘤細(xì)胞系，體外實驗證明其是有功能的。迄今為止，關(guān)于CD137L在人類原發(fā)腫瘤中的表達(dá)尚無研究報道。因此，本研究的目的主要是分析CD137和CD137L在人類原發(fā)腫瘤中的

12、表達(dá)，并深入研究它們在腫瘤免疫中的潛在作用。
　　 方法：
　　 一、病例收集：63例組織標(biāo)本來自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院的手術(shù)病人，其中包括12例
　　 正常組織，15例上皮及間葉組織來源的良性腫瘤組織(腺瘤和平滑肌瘤)，36例上皮來源的惡性腫瘤組織(鱗狀細(xì)胞癌和腺癌)。
　　 二、免疫組織化學(xué)法分析CD137和CD137L在上述冰凍切片中的表達(dá)。
　　 三、RT-PCR法分析CD137L在9株人類腫瘤

13、細(xì)胞系中的mRNA表達(dá)，其中包括3株肝癌細(xì)胞系，2株肺癌細(xì)胞系，2株結(jié)腸癌細(xì)胞系，1株淋巴瘤和1株白血病細(xì)胞系。
　　 四、為了分析腫瘤細(xì)胞表面CD137L的作用，將表達(dá)CD137L的腫瘤細(xì)胞與表達(dá) CD137的活化T淋巴細(xì)胞或CHO細(xì)胞共培養(yǎng)，ELISA法檢測細(xì)胞因子(IL-8， IFN-γ)的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 一、人類原發(fā)腫瘤組織可表達(dá)CD137和CD137L，但其表達(dá)部位不同
　　 C

14、D137和CD137L僅表達(dá)于人類良性(2/15，3/15)或惡性(15/36，21/36)腫瘤組織中，但不表達(dá)于正常組織中(0/12，0/12)。CD137表達(dá)于腫瘤組織血管壁的上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，而CD137L表達(dá)于腫瘤細(xì)胞。盡管樣本來自于不同的組織類型，CD137和CD137L的表達(dá)更常見于惡性腫瘤組織，尤其是中度或低度分化的惡性腫瘤組織。
　　 三、人類腫瘤細(xì)胞系表達(dá)高水平的CD137L
　　 上述實驗結(jié)果顯示

15、人類原發(fā)腫瘤組織中的腫瘤細(xì)胞可表達(dá)CD137L，我們進一步用RT-PCR法檢測了來源于不同原發(fā)組織的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞系表面CD137L的表達(dá)。結(jié)果顯示，正常未刺激的外周血單個核細(xì)胞不表達(dá)CD137L mRNA，但所有檢測的腫瘤細(xì)胞系(HepG2.2.15，BEL7402，HLE，HT29，L78，A2，U937，HL60，H6)均顯示高水平的CD137L表達(dá)。出乎意料的是非腫瘤細(xì)胞系，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304也表達(dá)CD137L。這些結(jié)

16、果顯示CD137L不僅表達(dá)于人類的原發(fā)腫瘤組織，也表達(dá)于腫瘤細(xì)胞系和一些非腫瘤細(xì)胞系，提示CD137L的表達(dá)可能與細(xì)胞的快速生長有關(guān)。
　　 三、腫瘤細(xì)胞表達(dá)的CD137L是有功能的
　　 為了研究腫瘤細(xì)胞表面CD137L的功能，我們將表達(dá)CD137L的腫瘤細(xì)胞與表達(dá)CD137的活化T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，ELISA法檢測IFN-γ的分泌。結(jié)果顯示，與不CD137的靜息T細(xì)胞相比，表達(dá)CD137的活化T淋巴細(xì)胞與L78細(xì)胞共培

17、養(yǎng)可產(chǎn)生高水平的IFN-γ(P<0.001)，用抗CD137L單抗封閉CD137-CD137L通路，IFN-γ的分泌水平則明顯降低(P<0.001)。
　　 為了驗證表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面的CD137L能否向腫瘤細(xì)胞傳遞信號，我們將不同的腫瘤細(xì)胞與表達(dá)CD137的CD137-CHO細(xì)胞共培養(yǎng)，ELISA法檢測IL-8的表達(dá)。結(jié)果顯示HepG2.2.15表面的CD137L與CD137-CHO表面的CD137交聯(lián)可促進腫瘤細(xì)胞IL-8的

18、分泌(P=0.038)。
　　 結(jié)論：
　　 一、CD137和CD137L可表達(dá)于不同的人類原發(fā)腫瘤組織，但其表達(dá)部位不同。CD137表達(dá)于腫瘤組織血管壁的上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，而CD137L表達(dá)于腫瘤細(xì)胞。
　　 二、腫瘤細(xì)胞表達(dá)的CD137L是有功能的，腫瘤細(xì)胞L78表面的CD137L與T細(xì)胞表面的CD137交聯(lián)可誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IFN-γ，HepG2.2.15表面的CD137L與CD137的交聯(lián)可促進