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文檔簡介
1、目的:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以滑膜炎為其基本病理改變的慢性全身性自身免疫性疾病。位于RA患者滑膜襯里層的成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(FLS)具有類似于腫瘤細(xì)胞的與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的黏附、遷移和侵襲的特征,在RA的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用。
課題組先前的研究顯示金雀異黃素(Gen)能夠抑制CIA大鼠FLS的增殖,抑制炎癥因子(TNF-α、IL-1β)的分泌,并有控制CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥、抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)破壞的作用。且相關(guān)文
2、獻(xiàn)報道顯示Gen可以抑制腫瘤細(xì)胞與ECM黏附及遷移、侵襲。故本實驗旨在探究Gen對RA-FLS與ECM的黏附、遷移和侵襲的影響及其可能存在的機(jī)制。
方法:
1、以人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞株(MH7A)作為研究對象,應(yīng)用CCK8細(xì)胞活力實驗研究不同濃度Gen對RA-FLS細(xì)胞活力的影響,選取對RA-FLS細(xì)胞活力無明顯影響的濃度進(jìn)行研究。
2、通過RA-FLS與ECM類似物(CollagenⅠ、Fi
3、bronectin、Matrigel)的黏附,研究Gen對RA-FLS與ECM黏附的影響。
3、通過細(xì)胞劃痕實驗、transwell細(xì)胞遷移實驗研究Gen對RA-FLS遷移的影響;
4、通過transwell細(xì)胞侵襲實驗研究Gen對RA-FLS侵襲的影響。
5、通過羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對RA-FLS的F-actin細(xì)胞骨架系統(tǒng)進(jìn)行染色,觀察Gen對RA-FLS肌動蛋白纖維的分布、絲狀和片狀偽足形成的影響。<
4、br> 6、應(yīng)用Western Blot檢測相關(guān)信號通路蛋白及MMP-2的表達(dá)水平以探究其中可能存在的機(jī)制。
研究結(jié)果:
1、細(xì)胞活力實驗的結(jié)果表明Gen在20μM、40μM、60μM組測得的細(xì)胞活力相較于空白對照組分別為98.30±2.90%、95.70±5.65%和92.70±7.01%,對RA-FLS的細(xì)胞活力均無明顯影響,故選取20μM、40μM、60μM濃度的Gen進(jìn)行進(jìn)一步實驗。
2、與ECM
5、類似物的黏附實驗結(jié)果表明,與對照組相比,RA-FLS在20μM、40μM、60μM組與CollagenⅠ的黏附率分別為97.43±1.18%、88.92±4.23%及78.25±4.90%,與Fibronectin的黏附率分別為95.18±2.00%、89.35±2.35%、78.43±3.27%,與Matrigel的黏附率分別為96.35±2.13%、84.96±3.21%、75.82±1.38%;Gen在40μM、60μM對RA-F
6、LS與CollagenⅠ、Fibronectin、Matrigel的黏附均有明顯的抑制作用,且在60μM時均較40μM時明顯,而20μM時對其黏附無明顯影響。
3、細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果表明,Gen在20μM、40μM、60μM均可以抑制傷痕的愈合,且隨著濃度的增加抑制作用越強(qiáng);在transwell細(xì)胞遷移實驗中,RA-FLS在20μM、40μM、60μM的遷移率相較于空白對照組分別為97.10±5.16%、77.97±5.44%及
7、51.95±5.26%;40μM、60μM的Gen對RA-FLS的遷移均有明顯的抑制作用,且60μM時更為明顯,但20μM時對其遷移無明顯影響。
4、Transwell細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果表明,RA-FLS在20μM、40μM、60μM的細(xì)胞侵襲數(shù)目相較于空白對照組分別為94.79±5.24%、64.54±10.13%及51.32±12.36%;40μM、60μM對RA-FLS的侵襲均有明顯的抑制作用,且60μM更為明顯,而20μ
8、M對其侵襲無明顯影響。
5、免疫熒光染色實驗的結(jié)果顯示Gen能夠使RA-FLS肌動蛋白細(xì)胞骨架重排,使張力纖維數(shù)目增多,片狀偽足和絲狀偽足的數(shù)量減少,且隨著濃度的增加這種作用越強(qiáng),在60μM濃度最明顯。
6、Western blot的結(jié)果顯示,與空白對照組相比Gen在20μM、40μM、60μM對RA-FLS中p-JNK、JNK、p-ERK、ERK水平無明顯影響; Gen在20μM濃度對RA-FLS的p-p38水平無
9、明顯影響,但在40μM、60μM濃度可以下調(diào)RA-FLS±中p-p38水平,而這些濃度對細(xì)胞中的p38水平則無明顯影響;并且Gen在這些濃度對RA-FLS中MMP-2的表達(dá)水平亦無明顯影響。
結(jié)論:
1、Gen在40μM、60μM濃度時可以抑制RA-FLS與ECM類似物(CollagenⅠ、Fibronectin、Matrigel)的黏附、遷移和侵襲,在20μM濃度時對RA-FLS與ECM類似物(CollagenⅠ、
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