硫酸化烏賊墨多糖對EGFR-Akt-p38 MAPK信號通路介導(dǎo)的腫瘤遷移及侵襲的影響及機制研究.pdf

1、研究目的：
　　癌癥的發(fā)病率與死亡率的居高不下，使得開發(fā)新的癌癥治療藥物變得迫在眉睫。90％以上的癌癥病人死于腫瘤轉(zhuǎn)移及其并發(fā)癥。其中，腫瘤細(xì)胞中的表皮生長因子受體(epidermal growthfactor receptor，EGFR)的過表達(dá)或異?；罨c腫瘤細(xì)胞從良性到惡性的轉(zhuǎn)變、癌癥病人的不良預(yù)后均密切相關(guān)。目前已經(jīng)有以EGFR為靶點的抗腫瘤臨床用藥，然而，絕大多數(shù)的抑制劑在使用后都出現(xiàn)了不同程度的耐藥現(xiàn)象。因此，開發(fā)新的

2、能抑制EGFR介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移藥物意義非常重大。
　　烏賊墨多糖(polysaccharide of Sepiella maindroni ink，SIP)是本課題組從曼氏無針烏賊的墨汁中分離得到的一種酸性多糖，具有抗突變誘導(dǎo)的作用。經(jīng)過氯磺酸-甲酰胺法對其進(jìn)行了硫酸化修飾，得到了硫酸化烏賊墨多糖(sulfatedpolysaccharide ofSepiella maindroniink，SIP-SⅡ)。在體外，SIP-SⅡ?qū)β殉?/p>

3、癌細(xì)胞SKOV-3的細(xì)胞活力沒有明顯影響，卻可以顯著抑制細(xì)胞遷移及侵襲，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。此外，SIP-SⅡ還可以明顯的降低SKOV-3細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)及活性。體內(nèi)活性研究表明，SIP-SⅡ可以抑制S180肉瘤的生長，還可以顯著降低B16F10人工肺轉(zhuǎn)移以及抑制血管生成。前期研究結(jié)果表明，SIP-SⅡ有望開發(fā)成一個安全的抗腫瘤轉(zhuǎn)移新藥。然而，對其作用機制的不明確限制了對SIP-SⅡ的進(jìn)一步開發(fā)利用。
　　為此，本課題通過

4、研究SIP-SⅡ在腫瘤細(xì)胞上的定位，對可能的作用靶點進(jìn)行篩選，而后，對信號通路進(jìn)行分析，以期探知SIP-SⅡ的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性機制。
　　研究方法：
　　1、SIP-SⅡ與細(xì)胞結(jié)合定位及對ErbB家族中EGFR的表達(dá)及活性的影響
　　將SIP-SⅡ進(jìn)行FITC標(biāo)記。而后，運用流式細(xì)胞術(shù)檢測SIP-SⅡ-FITC與細(xì)胞的結(jié)合。通過激光共聚焦顯微鏡技術(shù)，觀察SIP-SⅡ-FITC在不同細(xì)胞內(nèi)的位置，與特異性的膜染料及核染料進(jìn)

5、行共定位，得出SIP-SⅡ在給藥后，處在細(xì)胞什么位置。
　　運用Western blot法檢測了SIP-SⅡ?qū)rbB家族中4種蛋白質(zhì)的表達(dá)的影響，并檢測了SIP-SⅡ?qū)α姿峄疎GFR的作用。運用RT-PCR技術(shù)檢測了SIP-SⅡ?qū)GFR mRNA水平的影響。
　　2、SIP-SⅡ與EGFR之間的親和力以及對EGF刺激的細(xì)胞遷移及侵襲的影響
　　運用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測SIP-SⅡ與EGFR的細(xì)胞內(nèi)共定位，而后用

6、SPR技術(shù)檢測SIP-SⅡ與EGFR之間的親和力。運用Western blot法檢測了SIP-SⅡ?qū)GF刺激的EGFR活化以及MMP-2、MMP-9表達(dá)上調(diào)的作用。運用劃痕愈合實驗及基質(zhì)膠侵襲實驗分別檢測了SIP-SⅡ?qū)GF誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲的影響。
　　3、SIP-SⅡ?qū)I3K/Akt/mTOR和MAPKs信號通路及核轉(zhuǎn)錄因子的作用運用Western blot方法檢測了SIP-SⅡ?qū)I3K/Akt/mTOR及MA

7、PKs信號通路中的關(guān)鍵激酶PI3K、Akt、mTOR、JNK、ERK及p38MAPK的磷酸化水平的影向。此外，還用同樣的方法檢測了SIP-SⅡ?qū)GF刺激的EGFR、Akt、JNK、ERK及p38MAPK磷酸化的作用。隨后，檢測了SIP-SⅡ?qū)F-κB、AP-1(c-Jun及c-Fos)和AP-2表達(dá)的影響，以及對EGF刺激的NF-κB、AP-1的核轉(zhuǎn)位的作用。
　　4、SIP-SⅡ?qū)π盘柾返囊种萍捌淇鼓[瘤轉(zhuǎn)移活性間的關(guān)系

8、r>　　采用劃痕愈合實驗、transwell小室遷移實驗及基質(zhì)膠侵襲實驗檢測SIP-SⅡ的抗腫瘤遷移及侵襲活性與各通路抑制劑之間的關(guān)系。運用Western blot及RT-PCR實驗檢測SIP-SⅡ?qū)MP-2的表達(dá)的作用及SIP-SⅡ與各通路抑制劑聯(lián)合給藥時MMP-2的表達(dá)的變化。
　　研究結(jié)果：
　　1、SIP-SⅡ與細(xì)胞膜結(jié)合且抑制EGFR的表達(dá)及磷酸化
　　FITC可以以低取代度的方式對SIP-SⅡ進(jìn)行標(biāo)記。S

9、KOV-3細(xì)胞可以濃度依賴性地與SIP-SⅡ結(jié)合。結(jié)合后，絕大多數(shù)的SIP-SⅡ并不會穿過細(xì)胞膜，而是結(jié)合在細(xì)胞膜上。
　　SIP-SⅡ?qū)?xì)胞膜上的ErbB家族蛋白中的EGFR的蛋白表達(dá)有顯著的抑制作用，對其它三種，即ErbB2、ErbB3和ErbB4的表達(dá)沒有明顯的影響。對于磷酸化的EGFR，SIP-SⅡ同樣具有顯著的抑制作用。SIP-SⅡ?qū)GFR的轉(zhuǎn)錄也有顯著的抑制作用，表現(xiàn)為SIP-SⅡ顯著的降低了SKOV-3細(xì)胞中的EG

10、FR的mRNA水平。
　　2、SIP-SⅡ可與EGFR結(jié)合且可抑制EGF刺激的EGFR活化及腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲及MMP-2表達(dá)
　　SIP-SⅡ在細(xì)胞內(nèi)可以與EGFR實現(xiàn)共定位，且可以與重組的EGFR蛋白結(jié)合。在EGFR過表達(dá)細(xì)胞系中，SIP-SⅡ可以顯著抑制EGF刺激的EGFR自身磷酸化。對EGF刺激的腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲及MMP-2表達(dá)上調(diào)，SIP-SⅡ均有顯著的阻斷作用。不過，SIP-SⅡ?qū)GF誘導(dǎo)的KB細(xì)胞中MMP-

11、9的表達(dá)沒有明顯的影響。
　　3、SIP-SⅡ可以下調(diào)PI3K/Akt/mTOR及p38MAPK信號通路活性、阻斷EGF對這兩條信號通路的激活作用及降低核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1(c-Jun及c-Fos)和AP-2的表達(dá)
　　SIP-SⅡ顯著地抑制PI3K/Akt/mTOR及p38MAPK的磷酸化，對JNK及ERK的磷酸化則沒有明顯的作用。對于EGF刺激引起的信號通路活化，SIP-SⅡ可以明顯地阻斷EGF誘導(dǎo)的EGFR與

12、PI3K/Akt/mTOR及p38MAPK的活化。而對EGF的激活JNK及ERK作用，SIP-SⅡ沒有明顯的作用。SIP-SⅡ?qū)F-κB、AP-1(c-Jun及c-Fos)和AP-2的表達(dá)均有抑制作用。此外，SIP-SⅡ可以阻斷EGF誘導(dǎo)的NF-κB和c-Jun核轉(zhuǎn)位，對EGF誘導(dǎo)的c-Fos核轉(zhuǎn)位沒有影響。
　　4、SIP-SⅡ通過下調(diào)PI3K/Akt及p38MAPK抑制腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲
　　SIP-SⅡ與PI3K、

13、mTOR及p38MAPK的抑制劑在抑制SKOV-3細(xì)胞的遷移及侵襲、抑制MMP-2的表達(dá)上，均有協(xié)同作用。SIP-SⅡ與EGFR、PI3K及p38MAPK的抑制劑在阻斷EGF刺激的KB細(xì)胞的遷移及侵襲上，也表現(xiàn)出協(xié)同作用。
　　研究結(jié)論：
　　(1)SIP-SⅡ給藥后主要與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合，而不是進(jìn)入細(xì)胞。而且，SIP-SⅡ?qū)δど螮GFR蛋白的表達(dá)及活性產(chǎn)生抑制作用。
　　(2)SIP-SⅡ可以與EGFR蛋白結(jié)合，

14、而且能抑制EGF刺激的EGFR活化、腫瘤細(xì)胞遷移侵襲以及MMP-2表達(dá)的上調(diào)。
　　(3)SIP-SⅡ能夠抑制PI3K/Akt/mTOR和p38MAPK信號通路及其下游核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1和AP-2。對于EGF激活的PI3K/Akt和MAPKs信號通路及核轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位，SIP-SⅡ降低PI3K/Akt及p38MAPK信號通路的活性和NF-κB、c-Jun的核轉(zhuǎn)位。
　　(4)SIP-SⅡ是通過降低PI3K/Ak