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文檔簡介
1、研究苯及代謝物對體外培養(yǎng)正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞和臨床苯中毒患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞ToPoⅡα表達(dá)和活性的影響.探討ToPoⅡα表達(dá)的調(diào)控機(jī)制即ToPoⅡα啟動(dòng)子、啟動(dòng)子調(diào)控因子組蛋白乙?;⒓谆礁淖?觀察染苯人群或氫醌接觸后骨髓單個(gè)核細(xì)胞ToPo Ⅱα mRNA水平的動(dòng)態(tài)變化,探索TOPOⅡα啟動(dòng)子開始出現(xiàn)變化的時(shí)間.為更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)苯中毒相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理及相關(guān)疾病的診療提供一定的依據(jù). 方法: 1.Western Bl
2、ot法測定苯及代謝物對人骨髓單個(gè)核細(xì)胞ToPo Ⅱα含量變化的影響. 2.DNA超螺旋解旋法檢測撲異構(gòu)酶Ⅱ的活性:運(yùn)用ToPo Ⅱ檢測試劑盒檢測去連環(huán)動(dòng)質(zhì)DNA(]kDNA)的水平. 3.RT-PCR檢測體外氫醌(苯代謝產(chǎn)物)處理實(shí)驗(yàn)及臨床苯中毒病例ToPo Ⅱα mRNA水平的變化. 4.構(gòu)建染色質(zhì)免疫沉淀分析法(ChIP):在活細(xì)胞狀態(tài)下,用甲醛固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,然后用機(jī)械(超聲波)的手段將其隨機(jī)切斷
3、為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段.利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過抗原-抗體反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合體,然后沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段.經(jīng)蛋白質(zhì)與DNA解偶聯(lián),DNA片段純化等處理后,用PCR等方法檢測與蛋白質(zhì)的結(jié)合的DNA情況. 5.應(yīng)用chIP技術(shù),探討TOPOⅡα含量變化的可能機(jī)制:運(yùn)用特異性抗體,檢測TOPOⅡα含量變化及ToPoⅡα啟動(dòng)子及啟動(dòng)子調(diào)控因子(SPl、ATF-2、SP3、NF-YA
4、、NF-M、P53、C-MYB、C-JUN、ICBP90)組蛋白H3,H4 乙?;癏3K4,H3K9甲基化水平改變的關(guān)系. 6.RT-PCR測定臨床苯中毒病例TOPOⅡα啟動(dòng)子各調(diào)控因子mRNA表達(dá)水平的改變. 7.RT-FCR檢測氫醌(苯代謝產(chǎn)物)接觸不同時(shí)間后骨髓單個(gè)核細(xì)胞ToPoⅡα mRNA水平的動(dòng)態(tài)變化,應(yīng)用ChIP技術(shù),探討TOPOⅡα啟動(dòng)子開始出現(xiàn)變化. 結(jié)果: 1.體外實(shí)驗(yàn)氫醌誘導(dǎo)的正常
5、人骨髓單個(gè)核細(xì)胞中TOPO Ⅱα含量較正常對照組明顯下降,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.(P<0.01). 2.體外氫醌誘導(dǎo)組及臨床苯中毒病例實(shí)驗(yàn)檢測表明TOPO Ⅱα活性較對照組明顯受到抑制. 3.體外氫醌誘導(dǎo)組及臨床苯中毒病例實(shí)驗(yàn)檢測表明TOPO Ⅱα mRNA水平較對照組明顯下降,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.(P<0.01). 4.成功構(gòu)建染色質(zhì)免疫沉淀分析法(ChIP). 5.體外氫醌誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明TOPOⅡα含
6、量降低與TOPOⅡα啟動(dòng)子組蛋白H4乙?;?、H3K4甲基化水平降低及H3K9甲基化水平升高有關(guān):而臨床苯中毒病例實(shí)驗(yàn)研究則顯示TOPOⅡα含量降低不僅與TOPOⅡα啟動(dòng)子組蛋白H4乙?;健3K4甲基化水平降低及H3K9甲基化水平升高有關(guān)還與組蛋白H3乙酰化水平降低有關(guān).進(jìn)一步的臨床苯中毒病例研究提示TOPO Ⅱα含量下降與TOPO Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子(SP1、ATF-2、SP3、NF-YA、NF-M、P53、C-MYB、C-J
7、UN、ICBP90)組蛋白甲基化及乙?;礁淖冇嘘P(guān):SP1、ATF-2、SP3、NF-YA、NF-M、P53、C-MYB、ICBP90組蛋白H4、H3乙?;较陆? C-JUN組蛋白H4、H3乙?;綗o明顯改變;NF-YA、C-JUN組蛋白H3K4甲基化水平下降,SP1、ATF-2、SP3、NF-M、P53、C-MYB、ICBP90組蛋白H3K4甲基化水平無明顯改變;SP1、NF-M組蛋白H3K9甲基化水平升高,而ATF-2、SP
8、3、NF-YA、P53、C-MYB、C-JUN、ICBP90組蛋白H3K9甲基化水平無明顯改變. 6.臨床苯中毒病例TOPOⅡα啟動(dòng)子各調(diào)控因子mRNA表達(dá)水平的改變:與正常對照組相比,mRNA表達(dá)水平降低的有SP1、NF-YA、C-MYB、NF-M及C-JUN, ATF-2、ICBP90mRNA表達(dá)水平不變而SP3、P53mRNA表達(dá)水平則升高. 7.氫醌(苯代謝產(chǎn)物)接觸不同時(shí)間后骨髓單個(gè)核細(xì)胞TOPOⅡα mRNA
9、水平呈動(dòng)態(tài)下降,4h時(shí)mRNA水平下降開始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),ChIP后發(fā)現(xiàn)3.5h時(shí)TOPOⅡα啟動(dòng)子己出現(xiàn)改變(組蛋白乙酰化H4水平). 結(jié)論:1.苯及其代謝物導(dǎo)致人骨髓單個(gè)核細(xì)胞TOPOⅡα的表達(dá)(蛋白含量、mRNA水平)及活性受抑,與所致的造血細(xì)胞損傷有關(guān).2.TOPOⅡα表達(dá)下降的機(jī)制與TOPOⅡα啟動(dòng)子及部分啟動(dòng)子調(diào)控因子組蛋白H4、H3乙?;?組蛋白H3K4、H3K9甲基化水平改變有關(guān).3.氫醌接觸
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