三種細(xì)胞系中DNA聚合酶β基因片段的克隆及序列分析.pdf

1、授予單位代碼!立452學(xué)號(hào)或申請(qǐng)?zhí)柼?4112窆密級(jí)塵玨鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文論文題目：三種細(xì)胞系中DNA聚合酶B基因片段的克隆及序列分析作者姓名：學(xué)科門(mén)類：專業(yè)方向：秦冰醫(yī)學(xué)腫瘤修復(fù)基因?qū)熜彰?、職稱：章茜教授趙國(guó)強(qiáng)副教授二零零五年五月十三日鄭州大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文三種細(xì)胞系中DNA聚合酶B基因片段的克隆及序列分析細(xì)胞系是目前研究p01B功能應(yīng)用較多的宿主，是野生型和突變型p01D轉(zhuǎn)染的對(duì)象，了解它們自身p018的情況將有助于弄清食管

2、癌細(xì)胞的形態(tài)、生物學(xué)、免疫和細(xì)胞遺傳等方面的性狀，并且可以提供抗腫瘤發(fā)生發(fā)展的新思路。本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)己建立的三種細(xì)胞系中DNA聚合酶B的eDNA全基因克隆及序列分析，為進(jìn)一步研究pol8基因和食管癌之間的關(guān)系提供一個(gè)更可靠的依據(jù)和研究背景。方法從Ecal09、Eca9706和NIH3T3三種細(xì)胞系中提取總RNA，通過(guò)RT—PCR擴(kuò)增出polt3cDNA全基因編碼序列；將其連接在pGEM—TEasy質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化入JMl09，利用A111p抗

3、性和藍(lán)白篩選實(shí)驗(yàn)篩選轉(zhuǎn)化人細(xì)菌的陽(yáng)性菌落，運(yùn)用pGEM—TEasy載體克隆鑒定引物T7／SP6對(duì)連接的正確性進(jìn)行鑒定，從而確定陽(yáng)性克隆。且進(jìn)行DNA測(cè)序，與GenBank中對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較。結(jié)果L靶基因擴(kuò)增及酶切鑒定：通過(guò)RT—PCR擴(kuò)增出三個(gè)細(xì)胞系的polB全長(zhǎng)aDNA片段，經(jīng)EcoRI酶切鑒定正確。2克隆結(jié)果鑒定：將靶基因與pG叫一TEasy質(zhì)粒連接后，轉(zhuǎn)化入JI^109，藍(lán)白篩選后隨機(jī)選擇6個(gè)陽(yáng)性菌落以T7／SP6作為引物進(jìn)

4、行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度均為約11kb的陽(yáng)性克隆。3利用生物學(xué)軟件對(duì)重組質(zhì)粒中三種細(xì)胞系的目的基因與GenBank公布的polB基因序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)：(i)Ecal09中有3個(gè)核苷酸突變，325位A—G，721位A—G，1071位T—C，基因序列同源性為997％：②Eca9706中有4個(gè)核苷酸突變，721位A—G，768位c—T，80l位A—G，853位A—G，基因序列同源性為996％：@N1H3T3無(wú)突變發(fā)生。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功地對(duì)