家蠶細(xì)小病毒樣病毒(中國(guó)株)DNA聚合酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、家蠶細(xì)小病毒樣病毒(Bombyx mori parvo-like virus，BmPLV)是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的病毒。病毒基因組為單鏈、線型雙分子DNA(VD1，VD2)，末端是無(wú)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的反向重復(fù)序列，其最大特點(diǎn)是雙分子DNA獨(dú)立包裝。
　　 據(jù)生物信息學(xué)分析，家蠶細(xì)小病毒樣病毒基因組VD1鏈上的開(kāi)放閱讀框ORF4(VD1-ORF4)編碼DNA聚合酶，該酶可能直接參與病毒基因組的復(fù)制。病毒基因組這樣特殊的結(jié)構(gòu)暗示了該病毒可能具有與細(xì)

2、小病毒不同的復(fù)制方式。為了揭示家蠶細(xì)小病毒樣病毒中國(guó)株(BmPLV-Z)的復(fù)制機(jī)制，研究DNA聚合酶基因VD1-ORF4的功能就顯得尤為重要。
　　 本研究對(duì)家蠶細(xì)小病毒樣病毒中國(guó)株VD1-ORF4進(jìn)行了克隆，并分別在pET系統(tǒng)和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)該基因做了表達(dá)分析。主要結(jié)果如下：
　　 1.構(gòu)建具有DNA聚合酶基因主要功能域的原核表達(dá)載體
　　 由于VD1-ORF4全長(zhǎng)3318 bp，編碼的蛋白分子量達(dá)到12

3、0 kDa左右，不利于在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效地表達(dá)，因此本研究首先選擇了VD1-ORF4基因3'端2163 bp部分片段(VD1-ORF4/2163)在原核系統(tǒng)中表達(dá)。該片段編碼720個(gè)氨基酸，包含了DNA聚合酶的主要功能域，包括兩個(gè)3'-5'外切酶結(jié)構(gòu)域和五個(gè)聚合酶結(jié)構(gòu)域。將基因片段VD1-ORF4/2163與表達(dá)載體pET-30a連接，經(jīng)PCR和酶切鑒定表明，重組表達(dá)載體pET-30a-VD1-ORF4/2163構(gòu)建成功。
　　

4、 2.DNA聚合酶基因主要功能域的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定
　　 將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-VD1-ORF4/2163轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta TM2(DE3)pLysS，利用IPTG誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析顯示，在88 kDa處出現(xiàn)一條特異的蛋白帶，與預(yù)期的分子量大小相符。質(zhì)譜分析結(jié)果進(jìn)一步表明，表達(dá)的重組蛋白確實(shí)為VD1-ORF4所編碼。
　　 3.多克隆抗體

5、制備
　　 通過(guò)Ni-NTA柱純化重組蛋白，將純化好的重組蛋白用作抗原免疫新西蘭大白兔，制備抗血清，再經(jīng)ProteinA親和凝膠柱純化制得的多克隆抗體。SDS-PAGE電泳分析顯示，抗體的純化效果良好。
　　 4.利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行DNA聚合酶基因的真核表達(dá)
　　 將DNA聚合酶基因克隆到轉(zhuǎn)移載體pFasBacHTb上，經(jīng)轉(zhuǎn)座作用構(gòu)建了重組Bacmid-VD1-ORF4。將重組Bacmid-VD1-ORF4