Decorin(DCN)促進大鼠ADSCs的成肌分化及其移植治療mdx鼠的研究.pdf

1、Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD)是一種常見的X染色體連鎖隱性遺傳病，最早由法國神經(jīng)病學家Duchenne de Boulogne于1868年描述，后人為了紀念他將該病命名為DMD，Gowers更詳細地描述了該病，為了紀念他，將DMD的典型表現(xiàn)命名為Gowers征。DMD發(fā)病率約為，每3500個男嬰中有一個患該病，女性攜帶者的攜帶頻率為1/2300，是最常見的遺傳性神經(jīng)肌肉疾

2、病之一。該病的主要特征是：進行性的四肢近端骨骼肌萎縮并且無力，小腿腓腸肌假性肥大，并且及心肌和呼吸肌也有嚴重病變，心衰和呼吸衰竭常常是致死原因。
　　 目前對DMD仍無有效的治療辦法，研究主要集中在藥物治療、基因治療和細胞治療。藥物治療只能作用于DMD病理生理的特定環(huán)節(jié)，暫時緩解但無法阻止病情進展。基因治療是向靶細胞引入正常有功能的基因以糾正或補償致病基因所產(chǎn)生的缺陷，從而達到治療目的，但也存在表達效率低、分布局限、載體容量不足

3、以攜帶全長dystrophin基因、具有生物毒性等缺陷而致應用困難。DMD細胞治療包括成肌細胞和干細胞移植治療，成肌細胞移植采用局部注射，治療部位局限，不能治療心肌與膈肌損害，且dystrophin表達時間短，這些問題阻礙了成肌細胞移植的臨床應用；干細胞因攜帶人體正常的基因組，具有成肌分化潛能，是細胞移植治療DMD較為理想的選擇。
　　 目的：將decorin轉染給ADSCs，將細胞治療和抑制myostatin相結合，體內外觀察

4、decorin抑制myostatin后的成肌率變化并研究其機制，并檢測肌酶，肌力以及肌肉病理的變化，從而為ADSCs移植和抑制myostatin的作用結合起來治療DMD提供理論基礎。
　　 方法：
　　 ⑴7只雌性SD大鼠(4-6 week)用來進行ADSCs的培養(yǎng).在體內試驗，我們選用了34只mdx鼠(8-9 week)，隨機分成3組：(1)未治療組(mdx組)：經(jīng)放療但未治療的mdx小鼠10只(2)GFP-ADSCs

5、細胞移植治療組(GFP-ADSCs組)：7-9周鼠齡的mdx鼠(12只)進行GFP-ADSCs細胞尾靜脈移植(3)DCN-ADSCs細胞移植治療組(DCN-ADSCs組)：7-9周鼠齡的mdx鼠(12只)進行DCN-ADSCs細胞尾靜脈移植。10只C57BL/C鼠做為對照。在細胞移植后20周，在運動功能檢測后處死動物進行HE染色，免疫熒光檢測，Western Blot檢測。
　　 ⑵應用DMEM培養(yǎng)4-6周雌性SD大鼠脂肪干細胞

6、，按1×109/L密度接種于T-25培養(yǎng)瓶中，置37℃、體積分數(shù)為5％的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。48小時后換液一次，棄去未貼壁細胞，以后每3～4天換液1次。
　　 ⑶用重組慢病毒液在不同條件下對ADSCs進行轉染，流式細胞儀檢測轉染效率并探討其轉染的最佳條件。得出慢病毒轉染的最佳MOI(multiplicity ofinfection)。在最佳MOI值下，用含GFP的慢病毒和含GFP/DCN融合蛋白的慢病毒對ADSCs進

7、行轉染，得到含GFP的ADSCs(以下簡稱GFP-ADSCs或者GFP細胞)和含GFP和DCN融合蛋白的ADSCs(以下簡稱DCN-ADSCs或者DCN細胞)。
　　 ⑷未轉染的大鼠ADSCs、GFP-ADSCs和DCN-ADSCs經(jīng)5-氮胞苷誘導分化24小時后，改為含5％HS的DMEM誘導培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天、7天、14天。分別用免疫熒光和Western blot檢測各個時間段相對應的MyoD、Myogenin和MHC的表達情況

8、。對以上細胞進行成脂誘導，16天后，光鏡和油紅O染色觀察成脂情況。
　　 ⑸比較移植前和移植后20周mdx鼠的體重。移植后20周，分別解剖不同組的鼠，比較不同組鼠的腓腸肌，股直肌及脛前肌的重量。
　　 ⑹各組實驗鼠的腓腸肌組織整個取出，放入已經(jīng)用液氮冷凍的異戊烷3-5秒后，放入細胞凍存管后，浸入液氮中保存。OCT包埋，冰凍切片機切成5-6μm厚切片，做HE染色，鏡下觀察骨骼肌細胞的形態(tài)及變性壞死情況，肌纖維的粗細，核中心

9、移位纖維(centrally nucleated fiber，CNF)比例等情況。
　　 ⑺應用SPSS13.0分析軟件進行統(tǒng)計分析。資料的所有數(shù)值以均數(shù)±標準差表示。組間比較用方差分析，多組間顯著性差異比較采用F檢驗，兩兩比較采用Student-Neuls(S-N-K)檢驗和LSD檢驗。雙側檢驗，顯著性檢驗水準為α=0.05。
　　 結果：
　　 ①大鼠ADSCs表面標志抗原的表達：不表達成纖維細胞標志物CD3

10、4，而表達整合素家族類抗原標志分子CD29和黏附分子家族類抗原標志分子CD44及CD13。
　　 ②ADSCs經(jīng)成骨誘導液誘導后14天檢測可見橘紅色的鈣結節(jié)，為茜素紅S與鈣鹽形成的橘紅色復合物，對照組結果為陰性。
　　 ③ADSCs經(jīng)成脂誘導液誘導16天后，檢測有脂肪形成，細胞中含大小不等的脂肪滴，細胞核被脂滴擠于細胞一側，對照組為陰性。
　　 ④MyoD是在成肌過程中早期表達的成肌因子。表達主要在細胞核。GFP

11、-ADSCs和DCN-ADSCs經(jīng)過5-氮胞苷誘導分化后3天，進行免疫熒光染色。結果發(fā)現(xiàn)在GFP-ADSCs組中有平均9.8％的細胞胞核MyoD表達陽性，呈明亮的紅色熒光，而DCN-ADSCs組，MyoD陽性表達明顯增加，達到34.7％。Western Blot結果示：MyoD的表達在GFP-ADSCs組較少，而在DCN-ADSCs組其表達量明顯增加，與免疫細胞化學的結果基本一致。
　　 ⑤MHC是成肌晚期的標志物，肌管中的特異

12、性標志蛋白，表明肌管已經(jīng)完全分化成熟。主要表達于新生肌管的胞漿中。ADSCs經(jīng)過5-氮胞苷誘導分化14天后，進行免疫熒光染色，陽性細胞的胞漿呈紅色。結果發(fā)現(xiàn)GFP-ADSCs組中有平均4.2％的細胞胞核融合于MHC表達陽性的肌纖維中，而在DCN-ADSCs組中，達到8.6％。Western Blot結果示MHC的表達在GFP-ADSCs組較少，而在DCN-ADSCs組表達量明顯增加，與免疫細胞化學的結果基本一致。
　　 ⑥Mdx

13、鼠由于肌膜缺乏dystrophin表達，肌細胞會出現(xiàn)大量變性壞死，我們對移正常C57鼠、未治療mdx鼠及移植細胞后20周的各組mdx鼠的腓腸肌進行冰凍切片。正常C57鼠的腓腸肌橫切面可以觀察到肌細胞得大小和形態(tài)基本一致，肌細胞呈典型的多邊形，未見明顯肌萎縮和壞死。肌細胞核位于肌膜附近，在肌纖維間隙，幾乎沒有觀察到CNF，肌細胞間質未見炎細胞；肌纖維間隙正常，幾乎無纖維化，結構完整。而在未治療的mdx鼠腓腸肌中，可見大量的炎細胞，肌細胞因

14、萎縮變成圓形，肌細胞間間隙變寬，細胞大小不均，可見有新生肌纖維，其形狀較小。CNF現(xiàn)象嚴重，細胞間隙可見明顯纖維化。GFP-ADSCs組20周后可見肌組織內炎性細胞浸潤減輕，細胞大小趨向統(tǒng)一，核中心移位現(xiàn)象減少，纖維化有所減輕。而DCN-ADSCs組mdx鼠炎性細胞浸潤、核中心移位現(xiàn)象進一步減少。另外DCN-ADSCs組mdx鼠肌纖維有增粗。
　　 ⑦對移植后20周的各個實驗組進行myostatin，decorin的wester

15、n blot的檢測?？梢?，在mdx鼠myostatin表達最多，GFP-ADSCs組mdx鼠的myostatin有所下降，DCN-ADSCs組mdx鼠下降最明顯。而decorin的表達正好相反，mdx鼠表達最小，GFP-ADSCs組mdx鼠的decorin表達有所上升，而DCN-ADSCs組mdx鼠上升最明顯。Myostatin和decorin的表達是完全相反的。
　　 ⑧應用兔抗DYS抗體標記的IgG進行免疫熒光染色，結果發(fā)現(xiàn)

16、，對照組C57鼠腓腸肌肌膜呈完整的網(wǎng)狀紅色熒光，mdx鼠肌膜基本未見紅色熒光；GFP-ADSCs組mdx鼠，20周后肌膜DYS陽性纖維數(shù)大約占細胞總數(shù)的5.4％，部分肌膜DYS染色不連續(xù)，而在DCN-ADSCs組mdx鼠，DYS陽性纖維數(shù)大約占細胞總數(shù)的7.9％。
　　 結論：
　　 ⑴攜帶GFP和DCN的慢病毒載體可以有效轉染大鼠ADSCs，并可以持久表達綠色熒光。
　　 ⑵用5-氮胞苷誘導ADSCs成肌分化時

17、，DCN-ADSCs成肌率較GFP-ADSCs高，而成脂率低，證明decorin可以抑制myostatin對細胞成肌的抑制作用，促進ADSCs在體外向肌細胞的分化，同時抑制細胞向脂肪轉化。以上促進成肌的作用可能是通過提高myoD和myogenin表達實現(xiàn)的。
　　 ⑶在用ADSCs尾靜脈移植治療mdx鼠時，decorin中和mdx鼠體內產(chǎn)生的內源性myostatin后，可以降低肌酶的水平，使肌肉明顯肥大，肌力提高。并且可以改善m