蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的人microdystrophin基因治療DMD模型-mdx鼠的實驗研究.pdf

1、Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne musculardystrophy，DMD)是一種以骨骼肌進行性變性、壞死為主要病理特征的致死性X-性連鎖隱性遺傳性肌病，發(fā)病率為男性活嬰的1/3500。此病發(fā)生的主要原因是DMD基因部分區(qū)域的缺失、重復(fù)或點突變，導(dǎo)致肌細胞膜上該基因編碼的抗肌萎縮蛋白dystrophin的缺乏或結(jié)構(gòu)變異，引起肌細胞膜的形態(tài)和功能損害，致使肌纖維變性壞死而致?；颊叨嘤?0歲左右由于呼吸衰竭而死亡。

2、 對于此病目前尚無有效的治療方法，基因治療和干細胞移植被認為是治療該病最有希望的兩種途徑。但是基因治療的方式主要是局部肌肉注射，沒有有效的傳輸載體將治療的基因傳送到全身受損傷的部位，基因的表達僅局限于注射點周圍1mm以內(nèi)的范圍，而人體肌肉約占體重的40﹪，這極大限制了累及全身所有骨骼肌包括膈肌和心肌在內(nèi)的DMD的治療；而干細胞移植則存在免疫排斥問題，表達時間不持久，不能改善心肌、膈肌肌力和智力缺陷，局部注射分布范圍局限，血管途徑表達率低

3、等缺點，使它的臨床應(yīng)用受到限制。因此提高治療基因在體內(nèi)的表達效率以及選擇合適的載體將是治療DMD獲得成功的關(guān)鍵。 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)的一個十分獨特的現(xiàn)象，具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的蛋白能以一種目前尚不清楚的非典型途徑自主穿過細胞膜，并能在細胞間自由傳遞，甚至突破血腦屏障。將具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的蛋白與目的蛋白融合后，能使融合蛋白從表達的細胞傳遞到周圍的細胞，并保持目的蛋白的生物活性與功能。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白的這種獨特、高效的跨膜

4、轉(zhuǎn)運功能和在細胞問自主傳遞的特點，不僅徹底打破了傳統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移模式，而且為人類基因治療和新型疫苗研究帶來了新的曙光。迄今，已發(fā)現(xiàn)來源于果蠅的Antp、HIV的TAT，人單純皰疹病毒I型(HSV-1)、牛皰疹I(lǐng)型(BHV-I)、馬力克氏病毒I型(MDV-I)和偽狂犬病病毒(PRv)的VP22均具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的特性。本研究則利用HSV-1VP22基因的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，構(gòu)建含有HSV-1 VP22和microdystrophin的重組表達核酸質(zhì)粒

5、、重組腺病毒，然后分別研究其在體外的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力和體內(nèi)治療mdx鼠的效果。最后利用重組腺病毒轉(zhuǎn)染DMD模型鼠mdxMSCs細胞，對同種異體的mdx MSCs進行microdystrophin基因修飾，檢測microdystrophin在mdx MSCs中的表達水平；然后將經(jīng)microdystrophin基因修飾的同種異體的mdx MSCs通過靜脈移植來治療mdx模型小鼠，檢測microdystrophin在體內(nèi)的表達以及其對mdx鼠的運動功

6、能、核中心移位的影響，為最終應(yīng)用于臨床實驗提供理論基礎(chǔ)。 主要研究內(nèi)容如下： 1．構(gòu)建了含HSV-1 VP22和microdystrophin的重組表達核酸質(zhì)粒和重組腺病毒從質(zhì)粒pSINrep5-VP22中PCR擴增全長的VP22片段，經(jīng)酶切克隆到真核表達載體pVAXl和腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV中，分別命名為pAVP22和pCMV-VP22；然后從質(zhì)粒pBSK-MICRO酶切全長的microdystroph

7、in基因，分別克隆到pAVP22和pCMV-VP22中，構(gòu)建了含HSV-1 VP22和microdystrophin的重組表達核酸質(zhì)粒和重組腺病毒穿梭質(zhì)粒，分別命名為pAVP22-MICDYS和pCMV-VP22-AMICDYS。然后將pCMV-VP22-AMICDYS與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEASY-1在BJ5183細胞中發(fā)生同源重組，生成含VP22和microdystrophin的重組的腺病毒骨架質(zhì)粒pAde-VP2-MICDYS，然

8、后將重組骨架質(zhì)粒在293細胞中包裝、擴增，得到含VP22和microdystrophin的重組腺病毒。同時構(gòu)建單獨含VP22或microdystrophin的對照重組核酸質(zhì)粒pAVP22、pAMICDYS和重組腺病毒Ad-VP22、Ad-MICDYS。 2．體外研究質(zhì)粒介導(dǎo)的VP22對microdystrophin在不同細胞間的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用將構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒pAVP22-MICDYS通過質(zhì)脂體轉(zhuǎn)染到3T3細胞，48小時后檢測mic

9、rodystrophin的表達，同時收集轉(zhuǎn)染后的細胞上清，然后用上清感染C2C12細胞，45分鐘后檢測microdystrophin在C2C12中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VP22提高了microdystrophin在3T3細胞中的表達，同時可以介導(dǎo)VP22-microdystrophin蛋白在從3T3細胞到C2C12細胞間的轉(zhuǎn)導(dǎo)。 3．體內(nèi)研究質(zhì)粒介導(dǎo)的VP22對microdystrophin在mdx鼠肌肉中的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用通過肌肉注射重組

10、質(zhì)粒到mdx TA中，2周和16周后分別做肌肉組織冰凍切片，HE檢測肌肉病理的改善情況，RT-PCR、Western．blot及免疫組化檢測microdystrophin蛋白的表達。研究結(jié)果表明VP22能夠介導(dǎo)VP22-microdystrophin蛋白在肌肉細胞間的穿梭，并提高了microdystrophin在體內(nèi)表達效率，同時更好地改善了肌肉病理狀況。對mdx鼠進行腹腔注射(沿膈肌)重組質(zhì)粒，2周后做肌肉組織冰凍切片，HE檢測肌肉病

11、理的改善情況，RT-PCR和及免疫組化檢測microdystrophin蛋白的表達，同時用等電刺激檢測膈肌的收縮力改善狀況。研究結(jié)果表明VP22能夠介導(dǎo)VP22-microdystrophin蛋白穿過膈肌而在心肌中表達，而且還能明顯改善膈肌的病理狀況、提高膈肌的收縮力量，從而解決了基因治療部位局限，難以達到心肌、膈肌的問題。 4．體外研究腺病毒介導(dǎo)的VP22對microdystrophin在C2C12細胞間的轉(zhuǎn)導(dǎo)將構(gòu)建的重組腺病

12、毒Ad-MICDYS、Ad-VP22-MICDYS分別感染C2C12細胞，48小時后做RT-PCR和Western-blot檢測microdystrophin基因轉(zhuǎn)錄和表達水平，同時在不同的時間點用免疫組化和流式細胞儀檢測microdystrophin的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)48小時后，兩種腺病毒感染后microdystrophin在轉(zhuǎn)錄水平上沒有差異，但在蛋白水平上卻存在明顯差異。同樣免疫組化和流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)在12和24小時，VP22介導(dǎo)

13、的microdystrophin重組腺病毒感染的細胞和單獨含microdystrophin基因的腺病毒感染的細胞microdystrophin的表達量相差不大，但隨著時間的延長到48小時，VP22介導(dǎo)的microdystrophin重組腺病毒感染的細胞比單獨含microdystrophin基因的腺病毒感染的細胞microdystrophin的陽性數(shù)增加近1倍左右，感染效率分別為93.08﹪和55.37﹪。結(jié)果表明VP22可以介導(dǎo)VP22

14、-microdystrophin蛋白在C2C12細胞間的轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高腺病毒對C2C12細胞的感染效率。 5．腺病毒介導(dǎo)的microdystrophin治療DMD最佳劑量的確定通過肌肉注射不同劑量的重組腺病毒到mdx TA，2周后做肌肉組織冰凍切片，HE檢測肌肉病理的改善情況，免疫組化檢測microdystrophin蛋白的表達，分別計算肌細胞核中移情況和：microdystrophin陽性纖維數(shù)量，從而確定腺病毒治療DMD的最佳病

15、毒粒子劑量。研究結(jié)果表明隨著腺病毒劑量的升高，microdystrophin陽性肌細胞數(shù)也隨著增加；同時在較低劑量時，隨著腺病毒劑量的升高，肌肉核中移數(shù)也隨之減少，但是當(dāng)病毒劑量升到一定的數(shù)量時，肌肉核中移數(shù)量反而上升，說明腺病毒達到一定的劑量后會對肌肉產(chǎn)生毒性，而使肌肉的壞死得不到有效改善。研究結(jié)果最終確定腺病毒治療DMD的最佳劑量為3×10<'9>個病毒粒子。 6．體內(nèi)研究腺病毒介導(dǎo)的VP22對microdystrophin

16、在mdx TA中的轉(zhuǎn)導(dǎo)通過肌肉注射重組腺病毒到mdx TA，2周和2月后做肌肉組織冰凍切片，HE檢測肌肉病理的改善情況，免疫組化檢測microdystrophin蛋白的表達，同時2月后原位檢測等長拉伸誘導(dǎo)損傷后TA肌肉收縮力恢復(fù)情況。研究結(jié)果表明VP22能夠介導(dǎo)腺病毒攜帶的VP22-microdystrophin蛋白在肌肉細胞間穿梭，并提高了microdystrophin在體內(nèi)表達效率，同時更好地改善了肌肉病理狀況，而且未影響micro