AAV介導(dǎo)基因治療DMD肌肉和周圍神經(jīng)病變的前期實驗研究.pdf

1、Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne musculardystrophy，DMD)是一種以骨骼肌進行性變性、壞死為主要病理特征的致死性X-性連鎖隱性遺傳性肌肉疾病。此病發(fā)病率高，為活男嬰的1/3500?；颊叱Ｓ?～5歲隱襲起病，12歲左右喪失行走功能，20～30歲時因呼吸、循環(huán)衰竭而死亡。DMD像許多其他肌肉疾病一樣，晚期損害都不僅僅局限于肌肉，還涉及了神經(jīng)系統(tǒng)，引起疼痛、燒灼感、瘙癢、感覺異常、麻木、肌肉無力、甚至癱瘓等癥

2、狀。因此，在診斷和治療肌肉病變的同時，我們也要考慮神經(jīng)病變的因素。血腦屏障的存在影響了治療藥物和因子自外周組織進入神經(jīng)系統(tǒng)。因此，尋找一種能夠有效地將治療藥物和基因傳遞入病變的神經(jīng)系統(tǒng)以緩解癥狀的載體顯得非常重要。人們曾嘗試?yán)@過血腦屏障，直接將基因或基因載體注入腦脊液中，使其迅速、有效地到達病變部位。但此法破壞血腦屏障，并容易造成注射部位局部的損害。近年，尋找能夠通過血腦屏障的基因載體以及能夠逆向轉(zhuǎn)運的基因載體，將治療藥物和基因帶入神經(jīng)

3、系統(tǒng)，成為了這個領(lǐng)域的研究焦點。
　　 目的：選擇腺相關(guān)病毒作為載體，分別將myostatin的抑制劑follistatin蛋白的基因作為治療基因，LacZ基因作為標(biāo)記基因裝入載體。在構(gòu)建pBSKS-follistatin后，轉(zhuǎn)染正常小鼠的C2C12細(xì)胞，觀察其分化后的myoblast的形態(tài)變化，將含有follistatin、LacZ基因的腺相關(guān)病毒通過腹腔和肌肉注射遞送入正常ICR小鼠，然后分別檢測follistatin在體內(nèi)

4、的表達以及其對小鼠的體重、肌肉重量、肌纖維形態(tài)和大小、運動功能的影響和AAV載體對注射部位周圍的肌肉組織、周圍神經(jīng)，脊髓背根神經(jīng)節(jié)、脊髓神經(jīng)元軸突、脊髓神經(jīng)元以及雪旺氏細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況，為最終應(yīng)用于臨床提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 ⑴取正常ICR小鼠雙側(cè)卵巢，用Trizol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以此cDNA為模板，forward和reversed兩端DNA序列為引物，進行小鼠follistain基因的PC

5、R擴增，跑膠鑒定后回收目的片段。
　　 ⑵用T4連接酶將上述回收片段與pBSKS載體相連2～4小時后，行電轉(zhuǎn)化，在瓊脂平板上培養(yǎng)14～16個小時后用堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA，然后進行酶切鑒定和序列分析排除基因突變。
　　 ⑶以p BSKS-mouse-follistatin質(zhì)粒為模板，p BSKS-m-follistatin-SacⅠ和pBSKS-m-follistatin-XhoⅠ為引物進行含SacⅠ和XhoⅠ酶切位

6、點的小鼠follistatin的PCR擴增，行DNA沉淀后回收目的片段。
　　 ⑷先構(gòu)建含有小鼠follistatin基因和LacZ基因的腺相關(guān)病毒質(zhì)粒Pxx-cag-mouse-follistatin和PEMBL-cmv-LacZ，酶切鑒定和序列分析后，挑選正確的質(zhì)粒行大量制備，然后對大量制備后的質(zhì)粒進行酶切鑒定和序列分析。
　　 ⑸當(dāng)40盤接種于25cm2平板上的293細(xì)胞培養(yǎng)至75～80％融合時，分別將Pxx-ca

7、g-mouse-follistatin、pHelper和AAV9以及PEMBL-cmv-LacZ、pHelper和AAV8按3∶4∶1的比例轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)7～16小時后換液，48～72小時后收集病毒行PEG8000純化，然后用dot-blot的方法測定病毒濃度。
　　 ⑹當(dāng)接種于10cm2平板上的C2C12細(xì)胞長至50～60％融合時，用純化后的表達質(zhì)粒Pxx-cag-mouse-follistatin經(jīng)Lipofectamine

8、TM試劑盒轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞。1.5小時后，換含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后，換為含2％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基促進成肌分化。5～7天后行desmin免疫熒光染色觀察成肌分化的情況。
　　 ⑺分為AAV9-cag-mouse-follistatin新生鼠腹腔注射組和對照組、AAV9-cag-mouse-follistatin成年鼠肌肉注射組和對照組、AAV8-cmv-LacZ新生鼠腹腔注射組和對照組以及A

9、AV8-cmv-LacZ成年鼠肌肉注射組和對照組8組。
　　 ⑻注射8周后，麻醉、斷頸、去皮，比較不同組鼠的脛前肌、腓腸肌、股四頭肌、肱三頭肌、膈肌和心肌的重量。
　　 ⑼使用自動握力檢測儀、rota rod機和機動Treadmill機對AAV9-cag-mouse-follistatin新生鼠腹腔注射組和對照組小鼠的上肢握力、下肢肌力和平衡功能以及整體心肺功能進行測定。
　　 ⑽根據(jù)檢測需要分別取AAV8-cm

10、v-LacZ注射組和對照組小鼠的脊髓做冰凍切片，用抗β半乳糖苷酶抗體和抗神經(jīng)元胞體抗體合染，熒光顯微鏡觀察后拍照。
　　 ⑾根據(jù)檢測需要分別取AAV8-cmv-LacZ注射組和對照組小鼠的周圍神經(jīng)(坐骨神經(jīng)和腓神經(jīng))做冰凍切片，用抗β半乳糖苷酶抗體和抗髓鞘基蛋白抗體合染，熒光顯微鏡觀察后拍照。
　　 ⑿應(yīng)用SPSS13.0分析軟件進行統(tǒng)計分析。小鼠的體重、肌肉重量、肌纖維橫截面半徑和運動功能的所有數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，

11、根據(jù)不同數(shù)據(jù)進行單因素方差分析或t檢驗，顯著性檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 ①構(gòu)建了含小鼠follistatin和LacZ的重組表達核酸質(zhì)粒和重組腺病毒。測定后的AAV9-cag-mouse-follistatin和AAV8-cmv-LacZ病毒的濃度分別為2×1012v.g./ml和2.5×1012v.g./ml。
　　 ②真核表達質(zhì)粒Pxx-cag-mouse-follistatin通過質(zhì)脂體

12、轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞后，提高了C2C12細(xì)胞的分化率，同時使成肌分化后的C2C12細(xì)胞明顯增粗。
　　 ③研究結(jié)果表明AAV9能夠介導(dǎo)小鼠follistatin蛋白在全身骨骼肌肌肉細(xì)胞內(nèi)表達，使小鼠體重較對照組增加17.9％，且以骨骼肌肌肉組織的重量增加(較對照組增加了89～156％)為主而非其他組織的重量(如心肌和脂肪等)。注射組小鼠肌肉組織增生和肥大并存，但以肥大為主，而且增大的肌肉細(xì)胞均為有功能的細(xì)胞，它們能夠使小鼠的上肢

13、握力、下肢的肌力和平衡功能分別較對照組增強了約58％和90％。
　　 ④研究結(jié)果表明肌肉注射AAV9能夠介導(dǎo)小鼠follistatin蛋白在被注射肌肉細(xì)胞內(nèi)表達，使注射組小鼠肌肉明顯較對照組增大，肌肉重量增加(較對照組增加了126～180％)，且肌肉組織增生和肥大并存，但以肥大為主，這與新生鼠腹腔注射后的實驗結(jié)果是一致的。
　　 ⑤研究結(jié)果表明AAV8能夠介導(dǎo)LacZ蛋白在進入神經(jīng)系統(tǒng)，并在脊髓、脊髓背根神經(jīng)節(jié)和周圍神經(jīng)

14、中表達。而且，脊髓白質(zhì)中的LacZ陽性細(xì)胞較灰質(zhì)中多，下段脊髓的LacZ陽性細(xì)胞較上段多。這說明AAV8能夠通過腹腔注射進入神經(jīng)系統(tǒng)；離注射部位越近的地方，基因表達越高；且AAV8對白質(zhì)的感染效率大于灰質(zhì)。
　　 ⑥研究結(jié)果表明AAV8能夠介導(dǎo)LacZ蛋白進入神經(jīng)系統(tǒng)，并在注射側(cè)的肌肉、脊髓、腦干、脊髓背根神經(jīng)節(jié)和周圍神經(jīng)中表達；脊髓和腦干白質(zhì)中的LacZ陽性細(xì)胞較灰質(zhì)中多；離注射點越近的脊髓，LacZ陽性細(xì)胞越多；注射后時間越

15、長，發(fā)現(xiàn)LacZ陽性細(xì)胞的部位離注射點越遠。這說明AAV8能夠通過肌肉注射進入神經(jīng)系統(tǒng)，而且很有可能是通過逆向轉(zhuǎn)運的機制進入神經(jīng)系統(tǒng)的。
　　 ⑦成年小鼠的脊髓神經(jīng)元胞體、周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元軸突和髓鞘均能被AAV8轉(zhuǎn)染。
　　 結(jié)論：
　　 ⑴攜帶小鼠follistatin基因的腺相關(guān)病毒載體可以有效轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，促進其成肌分化。
　　 ⑵新生ICR鼠腹腔注射AAV9-cag-mouse-fol

16、listatin能夠使注射組小鼠體重增加、肌肉重量增加、肌纖維橫截面半徑增加和運動功能增強。
　　 ⑶成年ICR鼠肌肉注射AAV9-cag-mouse-follistatin能夠使注射組小鼠肌肉重量增加和肌纖維橫截面半徑增加。
　　 ⑷AAV8-cmv-LacZ能夠轉(zhuǎn)染小鼠的注射側(cè)肌肉、周圍神經(jīng)、脊髓背根神經(jīng)節(jié)、脊髓和腦。白質(zhì)中LacZ陽性細(xì)胞較灰質(zhì)多；離注射點越近，LacZ陽性細(xì)胞越多；注射后時間越長，發(fā)現(xiàn)LacZ陽性