抑制myostatin蛋白的作用促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成肌分化及其移植治療mdx鼠的研究.pdf

1、Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD)是一種X連鎖隱性遺傳病，以進(jìn)行性四肢近端骨骼肌萎縮無(wú)力、小腿腓腸肌假性肥大為特征，是最常見(jiàn)的神經(jīng)肌肉疾病?；颊叨嘤?0歲左右死于呼吸衰竭和/或心力衰竭。其病因是由于X染色體的抗肌萎縮蛋白基因突變，導(dǎo)致其編碼的基因產(chǎn)物抗肌萎縮蛋白(dystrophin，DYS)缺乏。 目前對(duì)DMD仍無(wú)有效的治療辦法，研究主要集中在藥物治療、基因治療和細(xì)

2、胞治療。藥物治療只能作用于DMD病理生理的特定環(huán)節(jié)，暫時(shí)緩解但無(wú)法阻止病情進(jìn)展。基因治療是向靶細(xì)胞引入正常有功能的基因以糾正或補(bǔ)償致病基因所產(chǎn)生的缺陷，從而達(dá)到治療目的，但也存在表達(dá)效率低、分布局限、載體容量不足以攜帶全長(zhǎng)DYS基因、具有生物毒性等缺陷而致應(yīng)用困難。DMD細(xì)胞治療包括成肌細(xì)胞和干細(xì)胞移植治療，成肌細(xì)胞移植采用局部注射，治療部位局限，不能治療心肌與膈肌損害，且dystrophin表達(dá)時(shí)間短，這些問(wèn)題阻礙了成肌細(xì)胞移植的臨床

3、應(yīng)用；干細(xì)胞因攜帶人體正常的基因組，具有成肌分化潛能，是細(xì)胞移植治療DMD較為理想的選擇。 骨髓干細(xì)胞移植被認(rèn)為是目前較有前途的治療方法。研究認(rèn)為骨髓中的造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells，MSCs)都具有分化為肌細(xì)胞的潛能，其中MSCs由于取材方便、來(lái)源豐富、容易培養(yǎng)、分化能力強(qiáng)而日益成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。MSCs具有多向分化潛能包

4、括可以向肌細(xì)胞分化已經(jīng)十分明確，但是其在體外、體內(nèi)向肌細(xì)胞分化的效率都還不高，而其中關(guān)鍵性的因素是什么并不清楚，也一直是廣大學(xué)者十分關(guān)心而未能解決的問(wèn)題。對(duì)于DMD患者來(lái)講，主要病理?yè)p害在骨骼肌組織，所以提高M(jìn)SCs移植后向骨骼肌分化的效率及參與骨骼肌功能修復(fù)的能力是必須的。上述問(wèn)題的解決對(duì)于MSCs移植治療DMD具有重要的臨床指導(dǎo)意義。 Myostatin(growth determining factor-8，GDF-8)是

5、最近才鑒定的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)/發(fā)育生長(zhǎng)因子超家族的一個(gè)新成員，它是一個(gè)結(jié)構(gòu)高度保守，影響肌肉發(fā)育和生長(zhǎng)的關(guān)鍵性負(fù)性調(diào)節(jié)因子，研究證明它的負(fù)性成肌調(diào)節(jié)作用主要是通過(guò)抑制肌前體細(xì)胞的增殖和分化，使這些細(xì)胞不能向骨骼肌轉(zhuǎn)化，最終影響骨骼肌的發(fā)育和生長(zhǎng)，而抑制myostatin的作用通路或基因突變所致myostatin的缺失，都可導(dǎo)致動(dòng)物和人的骨骼肌異常增生和肥大。MSCs在體外誘導(dǎo)成肌的過(guò)程中是否有myostatin的表達(dá)?而抑制

6、或阻斷它表達(dá)后的作用通路能否提高M(jìn)SCs向肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的比例?而在用MSCs移植治療mdx鼠時(shí)，如果用特異性抗體中和體內(nèi)產(chǎn)生的myostatin后，能否使移植的MSCs更多向骨骼肌分化并表達(dá)多量的dystrophin蛋白?以及它們的機(jī)制是什么?這些正是本研究所關(guān)心和要解決的問(wèn)題。 本研究擬將培養(yǎng)的MSCs首先在體外用5-氮胞苷進(jìn)行成肌分化誘導(dǎo)，檢測(cè)myostatin的表達(dá)，并用抗體中和產(chǎn)生的myostatin后，檢測(cè)MSCs體外成

7、肌分化的效率；然后在用MSCs移植治療mdx鼠時(shí)，用抗體中和mdx鼠體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性myostatin后，觀(guān)察MSCs在骨骼肌融合的比例和新生dystrophin的表達(dá)，從而為MSCs移植和阻斷myostatin的作用結(jié)合起來(lái)治療DMD提供理論基礎(chǔ)。 材料和方法: 1.實(shí)驗(yàn)材料 1.1試驗(yàn)動(dòng)物 3-4周齡的SD雄性大鼠15只作為供體鼠，用于MSCs的分離和培養(yǎng)，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞移植。7-9周：mdx鼠3

8、6只，12只為未治療組的陰性對(duì)照，12只為單純MSCs移植的實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，12只為myostmin抗體處理的實(shí)驗(yàn)組。分別于移植后1周、4周、16周取材，保持各組、各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物為4只。 1.2實(shí)驗(yàn)試劑與器材(略) 2.實(shí)驗(yàn)方法 2.1 MSCs的分離培養(yǎng)和鑒定 應(yīng)用DMEM培養(yǎng)SD大鼠骨髓干細(xì)胞，差速貼壁法分離、擴(kuò)增及純化MSCs，并進(jìn)行表面抗原鑒定，將形態(tài)一致的P5代MSCs用于體外實(shí)驗(yàn)和移植。 2

9、.2 體外誘導(dǎo)MSCs成肌分化時(shí)myostatin的免疫熒光、RT-PCR、Western Blot檢測(cè) 將P5代MSCs按1×10<'5>/孔接種至6孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)至60-70﹪融合時(shí)，實(shí)驗(yàn)組按終濃度10 μmol/L加入5-氮胞苷誘導(dǎo)分化24小時(shí)后，改為含2﹪HS的DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天、7天、14天，相應(yīng)對(duì)照組不給與5-氮胞苷。于不同時(shí)間點(diǎn)做免疫熒光、RT-PCR和Western Blot，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞m

10、yostatin的表達(dá)。 2.3 抗myostatin抗體在體外對(duì)MSCs誘導(dǎo)成肌分化的影響 經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)分化后的MSCs，其中實(shí)驗(yàn)組加入終濃度分別為2gg/ml、8gg/ml、16μg/ml的抗myostatin抗體，相應(yīng)對(duì)照組不給與myostatin抗體，繼續(xù)培養(yǎng)3天、7天、14天。取處理后3天的細(xì)胞用于MyoD、7天后的細(xì)胞用于myogenin、14天后的細(xì)胞用于MHC檢測(cè)，分別做免疫熒光、RT-PCR、Wes

11、tert Blot。 2.4 Mdx鼠移植前后的處理方案 在細(xì)胞移植前3天，對(duì)實(shí)驗(yàn)的mdx鼠進(jìn)行γ射線(xiàn)照射(7.0y劑量)。實(shí)驗(yàn)組于移植前1天腹腔注射抗myostatin抗體(6mg/kg)，以后每周一次，對(duì)照組則給予等量0.01 M PBS。 2.5 MSCs的標(biāo)記和移植 取生長(zhǎng)良好的p5代細(xì)胞，于移植前48小時(shí)、以終濃度為10μmol/L的BrdU摻入培養(yǎng)細(xì)胞中，尾靜脈注射入標(biāo)記的MSCs，移植細(xì)胞數(shù)

12、量為1.2X10<'7>/只。 2.6 MSCs移植后在mdx鼠體內(nèi)各器官的致瘤、致畸型觀(guān)察 BrdU標(biāo)記的MSCs移植入mdx鼠后在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)剖析各器官，觀(guān)察其形態(tài)結(jié)構(gòu)有無(wú)異常，有無(wú)腫瘤或者畸形的發(fā)生。 2.7 MSCs移植后16周肌酸激酶(CK)的測(cè)定 移植后分別取各組mdx鼠外周血1.2ml，取血清約250ul，用CK-NAC檢測(cè)CK值。 2.8 移植后16周mdx鼠肌肉組織HE染色

13、 分別取各組mdx鼠腓腸肌的冰凍切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，在鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，×400倍取8個(gè)視野，計(jì)數(shù)肌核中心移位纖維數(shù)目，并計(jì)算其比例。 2.9 移植后1周腓腸肌BrdU與Myod的免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè) 取移植后各組mdx鼠的腓腸肌進(jìn)行冰凍切片做免疫熒光雙標(biāo)染色，檢測(cè)Myod的表達(dá)情況及陽(yáng)性核的來(lái)源。 2.10 移植后8周腓腸肌BrdU與myogenin的免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè) 取移植后各組mdx鼠的腓腸肌進(jìn)行冰凍

14、切片做免疫熒光雙標(biāo)染色，檢測(cè)myogenin的表達(dá)情況及陽(yáng)性核的來(lái)源。 2.11 移植后16周腓腸肌BrdU與MHC的免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè) 取移植后各組mdx鼠的腓腸肌進(jìn)行冰凍切片做免疫熒光雙標(biāo)染色，檢測(cè)MHC的表達(dá)情況及陽(yáng)性纖維的來(lái)源。 2.12 移植后16周腓腸肌DYS的免疫熒光、RT-PCR、Western Blot檢測(cè) 取移植后各組mdx鼠的腓腸肌進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色、RT-PCR和Westemblo

15、t，檢測(cè)dystrophin的表達(dá)情況及陽(yáng)性纖維的來(lái)源。 2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0進(jìn)行檢驗(yàn)分析，有意義水平為P<0.05。 結(jié)論: 1.在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，。MSCs在用5.氮胞苷誘導(dǎo)成肌分化時(shí)，于不同階段都可表達(dá)大量的myostatin，通過(guò)其分泌作用抑制了MSCs向成熟肌管的進(jìn)一步分化。 2.應(yīng)用myostatin單克隆抗體在有效中和MSCs誘導(dǎo)分化時(shí)產(chǎn)生的my

16、ostatin后，抑制其負(fù)性成肌調(diào)節(jié)作用，可明顯促進(jìn)MSCs在體外向肌細(xì)胞的分化。 3.在用MSCs尾靜脈移植治療mdx鼠時(shí)，應(yīng)用myostatin單克隆抗體中和mdx鼠體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性myostatin后，在增加骨骼肌體積的同時(shí)，可以提高M(jìn)SCs移植后在體內(nèi)向骨骼肌細(xì)胞分化的成功率，并表達(dá)dystrophin蛋白。 4.在用myostatin抗體處理mdx后，沒(méi)有觀(guān)察到除骨骼肌外的其它組織器官的異常改變，說(shuō)明此方法是安