大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)及其誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、為了深入探討骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞多向分化的調(diào)控機(jī)制，為肥胖病、2型糖尿病、異位骨化等疾病提供細(xì)胞模型，本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)了SD大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，觀察了其生物學(xué)特性，進(jìn)行了利用成脂誘導(dǎo)劑和成骨誘導(dǎo)劑來對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞多向分化潛能的研究。 方法： 1．用混合酶對(duì)新生鼠骨骼肌組織進(jìn)行消化，用反復(fù)差速貼壁法(preplate technique)純化細(xì)胞。在低胎牛血清(2﹪FBS)條件下培養(yǎng)，觀察肌衛(wèi)星細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞和肌管的過程，并對(duì)相

2、應(yīng)的與肌分化相關(guān)的蛋白進(jìn)行了免疫熒光、Western Blot等分析以及細(xì)胞形態(tài)和生理功能的鑒定。 2．用成脂誘導(dǎo)液(10μg/ml胰島素)誘導(dǎo)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，通過油紅染色檢測其分化狀況，并利用RT-PCR技術(shù)檢測成脂關(guān)鍵基因過氧化氫酶體激活增殖受體γ(preoxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)的表達(dá)。 3．用成骨誘導(dǎo)液(10<'-7>mol/l地塞

3、米松、lμmol/lβ-甘油磷酸鈉和50μg/l維生素C)誘導(dǎo)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，通過細(xì)胞堿性磷酸酶活性和鈣化結(jié)節(jié)檢測分化狀況。 結(jié)果： (1)利用混合酶消化法分離，反復(fù)貼壁法純化得到數(shù)量較多、純度較高的肌衛(wèi)星細(xì)胞。肌衛(wèi)星細(xì)胞在20﹪FBS培養(yǎng)條件下可分裂增殖，細(xì)胞形態(tài)為梭形。換用2﹪FBS誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)條件下，可見骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞逐漸分化為成肌細(xì)胞，4天融合成肌管。與此同時(shí)，肌衛(wèi)星細(xì)胞分化為肌管的過程中出現(xiàn)了自

4、發(fā)性收縮現(xiàn)象。免疫熒光和Western blot分析發(fā)現(xiàn)：肌衛(wèi)星細(xì)胞desmin、cardiac troponin T抗體鑒定陽性，skeletal myosin抗體鑒定為陰性；肌管cardiac troponin T、skeletal myosin抗體鑒定為陽性；進(jìn)一步用a-銀環(huán)蛇毒素(a-bungarotoxin，a-BTX)鑒定肌細(xì)胞表面的乙酰膽堿受體(nicotine acetylcholine receptor，NAchR)的

5、表達(dá)，可見肌管乙酰膽堿受體呈塊狀聚集，而預(yù)先用乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)孵育后的肌管未見團(tuán)塊狀聚集；用Ach刺激肌管，可見乙酰膽堿明顯引起肌管的收縮，而預(yù)先用a-BTX孵育后的肌管用乙酰膽堿刺激后未見收縮。 (2)肌衛(wèi)星細(xì)胞在胰島素的刺激下向著脂肪細(xì)胞分化，利用RT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)成脂過程中的關(guān)鍵基因PPARγ在未誘導(dǎo)組有微弱表達(dá)，在胰島素誘導(dǎo)組明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 (3

6、)肌衛(wèi)星細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后，堿性磷酸酶染色陽性，并形成若干礦化結(jié)節(jié)。 小結(jié)： (1)與傳統(tǒng)的兩步消化法相比，利用混合酶消化法分離、反復(fù)差速貼壁法純化可得到數(shù)量較多、純度較高的肌衛(wèi)星細(xì)胞。 (2)胰島素可能通過增強(qiáng)PPARγ基因的作用來誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化。 (3)聯(lián)合應(yīng)用地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C可誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。 結(jié)論：利用本實(shí)驗(yàn)方法分離得到的SD大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞具