骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)和定向誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：為了深入探索骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞多向分化的調(diào)控機(jī)制，為臨床上重大肌病細(xì)胞移植治療提供理想的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)了SD大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，檢測(cè)了體內(nèi)骨骼肌成熟發(fā)育過程中的相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)行了5-氮胞苷誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的研究。 實(shí)驗(yàn)方法與研究?jī)?nèi)容： 1.用胰蛋白酶對(duì)新生鼠骨骼肌組織進(jìn)行消化，用新改良的percoll密度梯度離心法純化細(xì)胞，在低胎牛血清(2％FBS)條件下培養(yǎng)，觀察肌衛(wèi)星細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞、肌

2、管的過程，并對(duì)相應(yīng)的與肌分化相關(guān)的基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了免疫熒光等分析以及細(xì)胞形態(tài)和生理功能的鑒定等。 2.分別取胚胎大鼠、新生大鼠、成年大鼠骨骼肌組織，然后，再分別提取了肌細(xì)胞的總RNA和總蛋白，用RT-PCR方法分析了Myo-D、M-cadherin、GAPDH等基因在不同年齡階段的表達(dá)水平；同時(shí)用Westernblot法分析了skeletalmyosin蛋白在不同年齡階段的表達(dá)水平。 3.本研究在前期低血清誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細(xì)

3、胞分化的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索了5-氮胞苷(5-azacytidine)誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的過程。肌衛(wèi)星細(xì)胞在正常血清(15％FBS)條件下培養(yǎng)一周后，用無血清5-氮胞苷誘導(dǎo)24h，然后洗去5-氮胞苷并繼續(xù)在正常血清條件下培養(yǎng)二周，收集細(xì)胞用Westernblot方法分別對(duì)心肌特異表達(dá)的cardiactroponinT蛋白以及骨骼肌特異表達(dá)的skeletalmyosin蛋白進(jìn)行了鑒定和分析，用成年心肌組織做陽性對(duì)照。結(jié)果：

4、 1.用新改良的percoll密度梯度離心法分離的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的純度明顯高于用常規(guī)的差速帖壁法所得細(xì)胞的純度。肌衛(wèi)星細(xì)胞在15％FBS培養(yǎng)條件下可分裂增殖，細(xì)胞形態(tài)為梭形。換用2％FBS誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)條件下，可見骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞逐漸分化為成肌細(xì)胞，6天融合成肌管。與此同時(shí)，肌衛(wèi)星細(xì)胞分化為肌管的過程中出現(xiàn)了自發(fā)收縮現(xiàn)象。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)：肌管的desmin、skeletalmyosin抗體鑒定為陽性；進(jìn)一步用α-銀環(huán)蛇毒素鑒定不同

5、時(shí)期肌細(xì)胞表面的乙酰膽堿受體(nicotineacetylcholinereceptor，NAChR)的表達(dá)，只見肌管乙酰膽堿受體呈塊狀聚集，而肌衛(wèi)星細(xì)胞呈陰性反應(yīng)；用乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)分別刺激肌衛(wèi)星細(xì)胞、肌管，可見乙酰膽堿明顯引起肌管的收縮，而不引起肌衛(wèi)星細(xì)胞的收縮。 2.骨骼肌在成熟發(fā)育過程中，Myo-D基因表達(dá)水平隨年齡增加逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)出從胚胎期的微弱表達(dá)，到新生期較強(qiáng)表達(dá)，最后到成年期高水平

6、表達(dá)的模式(弱—強(qiáng)—最強(qiáng))。M-cadherin基因表達(dá)模式為：在胚胎期表達(dá)微弱，新生期表達(dá)增強(qiáng)，而到成年期完全無表達(dá)(弱—強(qiáng)—無)。skeletalmyosin蛋白表達(dá)模式為：在胚胎期表達(dá)微弱，新生期和成年期強(qiáng)表達(dá)(弱—強(qiáng)—強(qiáng))。 3.用5-氮胞苷(10μmol/L)誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細(xì)胞，可使誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)cardiactroponinT，不表達(dá)skeletalmyosin；作為陽性對(duì)照的成年心肌組織也只表達(dá)cardiactrop

7、oninT，不表達(dá)skeletalmyosin。相反，未經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)分化的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞只表達(dá)骨骼肌特異的skeletalmyosin，不表達(dá)心肌特異表達(dá)的cardiactroponinT。此外，5-氮胞苷誘導(dǎo)分化后的大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞自發(fā)收縮頻率比只是低血清誘導(dǎo)的細(xì)胞自發(fā)收縮頻率增加。 小結(jié)： 1.采用新改良的percoll密度梯度離心法早期培養(yǎng)的肌衛(wèi)星細(xì)胞純度明顯高于差速貼壁法，較好地滿足了下游實(shí)驗(yàn)需要。

8、 2.SD新生鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外低血清誘導(dǎo)時(shí)可自然向骨骼肌方向分化(成肌細(xì)胞，肌管)，并表達(dá)相應(yīng)的骨骼肌細(xì)胞特異的蛋白。 3.肌管可表達(dá)乙酰膽堿受體，乙酰膽堿受體在肌管的膜上呈塊狀聚集，用乙酰膽堿作用于肌管，可使肌管明顯收縮。而骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞乙酰膽堿受體呈陰性表達(dá)，對(duì)乙酰膽堿作用無收縮反應(yīng)。 4.在體外，5-氮胞苷(10μmol/L)可誘導(dǎo)(24h)大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞定向向心肌樣細(xì)胞分化，誘導(dǎo)后的細(xì)胞可表達(dá)心肌細(xì)胞特異

9、表達(dá)的cardiactroponinT蛋白。未經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)的細(xì)胞只表達(dá)骨骼肌特異的skeletalmyosin。 5.無論大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞自然分化形成的肌管，還是骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞經(jīng)5-氮胞苷定向誘導(dǎo)分化形成的肌管均存在自發(fā)收縮現(xiàn)象，但后者的收縮頻率增加。 結(jié)論： 體外培養(yǎng)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞具有多向分化潛能。在自然分化條件下向成熟骨骼肌方向分化，而5-氮胞苷則可定向誘導(dǎo)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞方向分化，因此，骨