胰島素信號對不同基因型小鼠ADSCs成脂后去分化的影響.pdf

1、迄今為止的國內(nèi)外研究表明，從動物體內(nèi)分離得到的內(nèi)臟或皮下白色成熟脂肪細胞在無外源胰島素的體外培養(yǎng)條件下，可自主發(fā)生去分化；而添加胰島素則可維持其原有成熟表型、抑制其去分化。我推測胰島素信號與脂肪細胞去分化存在相關(guān)性。然而胰島素信號影響脂肪細胞去分化的分子機制尚不明了。
　　本文采用形態(tài)學(xué)和分子細胞生物學(xué)檢測手段，通過研究胰島素信號對肥胖和非肥胖小鼠成脂細胞去分化的影響，進而對不同遺傳背景小鼠的內(nèi)臟白色脂肪細胞去分化機制進行初步探討

2、。
　　本文選用7-8周齡的四種基因型（C57BL/6J遺傳背景，WT、TNF-α-/-、Leprdb/db以及DT）雄性小鼠為實驗材料。前兩種小鼠為非肥胖小鼠，后兩種為遺傳性自發(fā)性肥胖小鼠。首先，使用經(jīng)典的“雞尾酒法”，分別誘導(dǎo)上述不同基因型小鼠內(nèi)臟原代白色脂肪干細胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）體外成脂分化為成熟脂肪細胞，然后，采用不同的方法處理細胞，令其去分化。共設(shè)三組：
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3、1）單純對照組，成脂誘導(dǎo)后10天后去除胰島素，細胞繼續(xù)培養(yǎng)于含有10％胎牛血清的完全生長培養(yǎng)基中（含有未知的微量胰島素）；
　　（2）干預(yù)組，在去除胰島素的同時添加胰島素信號抑制劑（OSI-906, linstinib），細胞繼續(xù)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的完全生長培養(yǎng)基中；（3）DMSO對照組，在去除胰島素的同時添加OSI-906的溶劑（DMSO），細胞繼續(xù)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的完全生長培養(yǎng)基中。三組細胞去分化實驗開始后，在相

4、應(yīng)培養(yǎng)條件下，繼續(xù)培養(yǎng)8天。
　　此外，為了驗證去分化的成脂細胞（dedifferentiated fat cells, DFATCs）是否重新獲得干細胞特性，對其進行了成脂再分化和成骨轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)實驗。
　　通過一般形態(tài)學(xué)和特殊染色方法，以及針對脂解、成脂、胰島素信號通路和脂肪干細胞相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的檢測，探究胰島素信號對不同基因型小鼠成脂細胞去分化的影響。結(jié)果如下：
　　1.分離純化WT小鼠ADSCs，以確

5、定成脂分化、成脂后去分化以及DFATCs成脂再分化的檢測時期。通過細胞形態(tài)變化特征確定了以下五個時期：成脂分化0天（D0）、10天（ D10），成脂后去分化3天（ DD3）、8天（ DD8）， DFATCs成脂再分化10天（RD10）。
　　2.選用不同濃度（0、0.1、0.3和1μM）的胰島素信號通路抑制劑（OSI-906）干預(yù)WT ADSCs成脂分化。通過細胞形態(tài)變化特征和靶蛋白表達水平的檢測結(jié)果，確定了在胰島素和血清均存在的

6、條件下完全抑制胰島素信號通路的最小藥物（OSI-906）濃度。結(jié)果表明0.3μM最佳。
　　3.形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果：
　　（1）ADSCs成脂誘導(dǎo)10天后成功分化為成熟脂肪細胞；
　?。?）成熟脂肪細胞隨著去分化時間的延長逐漸發(fā)生去分化，DD8時完成去分化；
　?。?）去分化速率為：干預(yù)組>對照組，單純對照組≈DMSO對照組；
　　（4）干預(yù)組和對照組的DFATCs成脂誘導(dǎo)10天后，再分化為成熟脂肪細胞，兩組之

7、間的成脂率無顯著差異；
　?。?）WT、TNF-α-/-、Leprdb/db以及DT小鼠ADSCs的形態(tài)變化特征差異不大。
　　4.WT、TNF-α-/-、Leprdb/db以及DT小鼠的對照組和干預(yù)組DFATCs獲得前后的脂肪干細胞標(biāo)志CD105表達持續(xù)上升；WT DFATCs成骨誘導(dǎo)21天后，茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色結(jié)果為陽性，表明DFATCs重新獲得干細胞特性。
　　5.實時熒光定量RT-PCR（qPCR）檢測結(jié)果顯示：

8、在小鼠成脂細胞去分化過程（DD0至DD8）中，胰島素信號通路關(guān)鍵因子AKT、GLUT-4的mRNA表達水平無顯著變化；成脂相關(guān)因子C/EBPα、PPARγ、adiponectin和SREBP-1的mRNA表達水平持續(xù)下降；脂解關(guān)鍵因子ATGL的mRNA表達水平呈先升高后下降的趨勢。單純對照組、DMSO對照組進行比較發(fā)現(xiàn)，兩個對照組之間無顯著差異。與對照組相比，OSI-906干預(yù)組的ATGL的mRNA表達水平上調(diào)，C/EBPα、PPARγ

9、、adiponectin和SREBP-1的mRNA表達水平下調(diào)。
　　另外，WT、TNF-α-/-、Leprdb/db以及DT小鼠ADSCs的各檢測分子在基因轉(zhuǎn)錄水平的表達變化趨勢一致，主要差異在于各檢測分子（同一時期和同一組）的相對表達量有所不同。
　　6.Western Blotting結(jié)果顯示：在ADSCs成脂后去分化過程中（ DD0至DD8）， p-AKT（Thr308）的蛋白激活水平大幅下降，GLUT-4的蛋白表達

10、水平呈先上升后下降的變化趨勢，SREBP-1和adiponectin的蛋白表達水平在去分化早期（DD3）已下降至檢測極限。比較三組結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純對照組和DMSO對照組間無顯著差異，OSI-906干預(yù)組的p-AKT（Thr308）的蛋白激活水平極顯著低于對照組。
　　另外，WT、TNF-α-/-、Leprdb/db以及DT小鼠ADSCs的各檢測分子在基因翻譯水平的表達變化趨勢一致，主要差異在于各檢測分子（同一時期和同一組）的相對表達