高胰島素對(duì)早孕小鼠子宮內(nèi)膜功能的影響.pdf

1、目的：激素在胚胎植入過(guò)程及妊娠的維持中均起著重要的調(diào)控作用。以往對(duì)妊娠中激素的研究多集中于雌激素和孕激素與子宮內(nèi)膜功能的關(guān)系，關(guān)于胰島素是否參與了妊娠早期子宮內(nèi)膜容受性及蛻膜化建立的研究報(bào)道甚少。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜上存在胰島素受體。臨床高胰島素血癥的育齡婦女（如肥胖患者），大多數(shù)伴有不孕和早期流產(chǎn)。因此，本研究擬從子宮內(nèi)膜容受性和子宮內(nèi)膜蛻膜化兩個(gè)角度，探討高胰島素對(duì)早孕小鼠子宮內(nèi)膜功能的影響，以了解胰島素對(duì)妊娠過(guò)程的調(diào)節(jié)，為臨床高胰

2、島素血癥導(dǎo)致的不孕癥、自然流產(chǎn)的診斷與治療尋求新的手段。
　　方法：
　　1、建立高胰島素小鼠模型：實(shí)驗(yàn)組采用長(zhǎng)效胰島素長(zhǎng)時(shí)間梯度劑量皮下注射，對(duì)照組用同等劑量生理鹽水皮下注射的方法構(gòu)建動(dòng)物模型。監(jiān)測(cè)小鼠血糖及體重。23天后，采用Elisa方法對(duì)小鼠血清胰島素水平進(jìn)行檢測(cè)，判斷高胰島素小鼠模型是否建立成功。
　　2、建立小鼠妊娠模型：高胰島素小鼠模型建立成功后，將胰島素處理組和對(duì)照組的雌性小鼠與正常雄性小鼠交配，晚上8

3、點(diǎn)左右合籠（雌性：雄性，2:1），次日早上8點(diǎn)左右檢查陰栓?？吹疥幩ǖ臑槿焉锏?天（D1），苦味酸標(biāo)記受孕小鼠。收集D4、D5、D6、D7和D8天孕鼠子宮內(nèi)膜組織。人工誘導(dǎo)蛻膜化模型：將胰島素處理組和對(duì)照組的雌性小鼠與輸精管結(jié)扎的雄性小鼠合籠交配，次日看到陰栓的為假孕第1天（PD1）。小鼠假孕4天（PD4）一側(cè)宮角注射玉米油100μl誘導(dǎo)蛻膜化，對(duì)側(cè)宮角不注射作為對(duì)照，于 PD8處死，收集子宮組織。
　　3、高胰島素對(duì)早孕小鼠子宮

4、內(nèi)膜功能的影響：Elisa方法檢測(cè)小鼠血清胰島素、孕酮和雌二醇水平；解剖觀察子宮大體形態(tài)；HE染色法觀察子宮的微細(xì)結(jié)構(gòu)；實(shí)時(shí)定量熒光PCR，蛋白質(zhì)印跡法和免疫組織化學(xué)檢測(cè) D4和 D5天小鼠子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)標(biāo)記物 Esr1、Esr2、Pgr和Hoxa10的表達(dá)及D6、D7和D8天小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化相關(guān)標(biāo)記物Pgr、Esr2、Bmp2和Prl的表達(dá)。western blot對(duì)mTOR信號(hào)通路子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)分子的表達(dá)進(jìn)行分析。最后，計(jì)

5、數(shù)并比較胰島素處理組與對(duì)照組孕鼠的妊娠天數(shù)及每窩幼崽數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1、高胰島素小鼠模型的構(gòu)建及血清激素分析：胰島素處理組小鼠血糖及血清胰島素水平顯著高于對(duì)照組，模型構(gòu)建成功。此外，胰島素處理組小鼠血糖和HOMA值顯著高于對(duì)照組，提示胰島素處理組小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗。血清激素檢測(cè)結(jié)果顯示，胰島素處理組血清E2顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05），P4顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　2、高胰島素影響妊娠早期小鼠的

6、子宮內(nèi)膜容受性：胰島素處理組與對(duì)照組比較，D4和D5天子宮的大體形態(tài)及微細(xì)結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著差異，且 D5天的胚胎著床點(diǎn)數(shù)量也沒(méi)有顯著改變（P＞0.05）。但是進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，D4天胰島素處理組孕鼠子宮內(nèi)膜組織的Esr1、Pgr和Hoxa10 mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著增高（P＜0.05），而Esr2 mRNA表達(dá)下降。D5天胰島素處理組Esr2和Hoxa10 mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著增高（P＜0.05），Esr1 mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著降低

7、（P＜0.05），western blot檢測(cè)到其蛋白表達(dá)量與基因表達(dá)一致。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：D4天對(duì)照組 Esr1、Esr2、Pgr和 Hoxa10在子宮上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核均顯現(xiàn)為棕黃色，表達(dá)均為陽(yáng)性,胰島素處理組Esr1、Pgr和Hoxa10為棕黑色，表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性，而Esr2顯現(xiàn)棕黃色，表達(dá)為陽(yáng)性。D5天對(duì)照組Esr2、Pgr和Hoxa10在子宮上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核均顯現(xiàn)為棕黃色，表達(dá)均為陽(yáng)性,胰島素處理組Esr2

8、、Pgr和Hoxa10為棕黑色，表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性，而Esr1顯現(xiàn)棕黃色，表達(dá)為陽(yáng)性。
　　3、高胰島素抑制孕鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化：D6天胰島素處理組子宮形態(tài)與對(duì)照組比較無(wú)顯著差別，D7和 D8天胰島素處理組子宮部分胚胎著床點(diǎn)形態(tài)與對(duì)照組相比體積變小。D6、D7和D8天胚胎著床點(diǎn)數(shù)量顯著減少（P＜0.05），且微細(xì)結(jié)構(gòu)可見(jiàn)部分胚層發(fā)育不全。人工誘導(dǎo)蛻膜化模型小鼠子宮形態(tài)不規(guī)則，可見(jiàn)胞質(zhì)空泡化的蛻膜細(xì)胞。在D6、D7和 D8天人工誘導(dǎo)蛻膜化模

9、型中，胰島素處理組孕鼠子宮蛻膜組織的Prl、Bmp2、Pgr和Esr2 mRNA表達(dá)均較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）；western blot檢測(cè)到Prl、Bmp2、Pgr和Esr2蛋白表達(dá)量也均較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）。Pgr和Esr2表達(dá)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：在D6、D7和 D8天,對(duì)照組子宮上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核均顯現(xiàn)為棕黃色，表達(dá)為陽(yáng)性，而在胰島素處理組顯示淺黃色，表達(dá)為弱陽(yáng)性。在D6和D7天, Bmp2在D6和D

10、7天對(duì)照組子宮上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核均顯現(xiàn)為棕黃色，表達(dá)為陽(yáng)性，D8天顯現(xiàn)為棕黑色，表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性，但在D6、D7和D8天胰島素處理組均顯現(xiàn)為淡黃色，表達(dá)為弱陽(yáng)性。Prl在D6、D7和D8天對(duì)照組子宮上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核均顯現(xiàn)為棕黑色，表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性。而胰島素處理組均顯現(xiàn)為淡黃色，表達(dá)為弱陽(yáng)性。
　　4、高胰島素影響妊娠早期子宮內(nèi)膜 mTOR通路：對(duì) D4、D5和D6天孕鼠子宮內(nèi)膜 mTOR信號(hào)通路的相關(guān)蛋白 mTOR、p-

11、mTOR、p70S6K和p-p70S6K的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，胰島素處理組的p-mTOR和p-p70S6K蛋白表達(dá)均較對(duì)照組顯著增高（P＜0.05）。
　　5、高胰島素導(dǎo)致小鼠妊娠延長(zhǎng)和產(chǎn)仔數(shù)減少：胰島素處理組的小鼠平均妊娠天數(shù)（21±0.71天）顯著高于對(duì)照組（18±0.50天）（P＜0.05）；胰島素處理組的小鼠平均每窩生的幼崽數(shù)量（10±0.50只）顯著低于對(duì)照組（13±1.12只）（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、

12、胰島素處理組小鼠血糖和HOMA值顯著高于對(duì)照組，提示在高胰島素的作用下，小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗。E2顯著低于對(duì)照組，P4顯著高于對(duì)照組，提示高胰島素導(dǎo)致孕鼠體內(nèi)激素紊亂。
　　2、胚胎植入早期可以劃分為兩個(gè)關(guān)鍵的時(shí)期：第一期，子宮處于容受胚泡的狀態(tài)以使胚泡獲得著床的能力，此期也被稱(chēng)為植入“窗口期”；第二期，胚泡完全被包埋入子宮內(nèi)膜，子宮內(nèi)膜蛻膜化反應(yīng)。在植入“窗口期”，胰島素處理組孕鼠胚胎個(gè)數(shù)和子宮內(nèi)膜的微細(xì)結(jié)構(gòu)與對(duì)照組沒(méi)有顯著變化，

13、但是子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因及蛋白Esr1、Esr2、Pgr和Hoxa10表達(dá)異常，提示盡管在高胰島素的作用下胚胎可以著床，但早孕小鼠子宮內(nèi)膜容受性輕微受損。
　　3、在子宮內(nèi)膜蛻膜化期，胰島素處理組孕鼠胚胎個(gè)數(shù)顯著減少，且部分孕鼠胚胎著床點(diǎn)的大體形態(tài)異常，且子宮內(nèi)膜蛻膜化的相關(guān)基因及蛋白Prl、Bmp2、Pgr和Esr2均表達(dá)異常。說(shuō)明高胰島素能夠影響子宮內(nèi)膜蛻膜化。
　　4、孕鼠血液中胰島素水平增高會(huì)導(dǎo)致延長(zhǎng)妊娠，并且導(dǎo)致