HCMV IE86介導(dǎo)的乙酰化調(diào)控參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展的作用機(jī)制研究.pdf

1、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染和惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤關(guān)系密切，病毒編碼的最主要即刻早期調(diào)控蛋白IE86與p300/CBP形成復(fù)合體，激活宿主細(xì)胞多種轉(zhuǎn)錄因子，在感染過程起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)IE86可與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子CREB相互作用，同時(shí)我們前期研究發(fā)現(xiàn)CREB/ATF家族新成員轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)也可與p300/CBP相互結(jié)合。ATF5是一個(gè)與腫瘤、特別是膠質(zhì)瘤密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中特異性高表達(dá)，可通過調(diào)控下游基因Eg

2、r-1，Bcl-2及Mcl-1等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制凋亡。 本項(xiàng)目首先在臨床病理標(biāo)本中確證HCMV感染與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)及ATF5表達(dá)之間的關(guān)系;再通過CoIP、激光共聚焦等技術(shù)研究IE86與ATF5在細(xì)胞內(nèi)相互作用模式和共定位;在此基礎(chǔ)上建立IE86過表達(dá)膠質(zhì)瘤細(xì)胞荷瘤鼠模型，研究IE86蛋白對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為和ATF5乙?；降挠绊?。項(xiàng)目以表觀遺傳調(diào)控乙酰化作用為切入點(diǎn)，研究HCMV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)漫長(zhǎng)的感染過程中，IE

3、86是如何調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平變化，進(jìn)而參與神經(jīng)細(xì)胞惡性行為的進(jìn)程。研究從一個(gè)新的角度來探討HCMV感染在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展過程中所扮演的角色。
　　目的:
　　1.檢測(cè)不同臨床分級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本中HCMV感染率、IE86表達(dá)與ATF5表達(dá)的相關(guān)關(guān)系。分析HCMV IE86在不同分級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)的差異，以其確證HCMV感染與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。
　　2.建立體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型，研究HCMV

4、 IE86與ATF5的相互作用，以及該作用對(duì)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子蛋白乙?；胶蜕飳W(xué)行為的影響及其分子機(jī)制。
　　3.建立IE86過表達(dá)膠質(zhì)瘤細(xì)胞裸鼠荷瘤模型，研究IE86蛋白對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的影響及可能的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.通過免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測(cè)不同臨床病例分級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本中HCMV IE86和ATF5的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析HCMV感染及ATF5表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生及進(jìn)展的相關(guān)性。
　　2.擴(kuò)增

5、HCMV病毒，測(cè)定病毒滴度。體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87，設(shè)立無血清培養(yǎng)組，病毒感染及IE86轉(zhuǎn)染組，qRT PCR、western-blot檢測(cè)IE、ATF5等基因的表達(dá)變化;MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率改變。觀察病毒感染及IE86轉(zhuǎn)染在培養(yǎng)基血清撤離環(huán)境下，對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響。同時(shí)設(shè)立ATF5 RNAi表達(dá)抑制組，研究ATF5參與病毒感染及IE過表達(dá)引起腫瘤增殖凋亡改變中的分子機(jī)制。
　　3.利用激光共聚焦技術(shù)觀察體

6、外培養(yǎng)的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中IE86與ATF5的亞細(xì)胞水平共定位;利用免疫共沉淀技術(shù)研究IE86蛋白與ATF5的相互作用，同時(shí)利用Western blot、免疫共沉淀技術(shù)分析IE86過表達(dá)對(duì)ATF5表達(dá)及乙酰化水平的影響。探討HCMV IE86蛋白調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制。
　　4.將IE86過表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87注射入裸鼠腋下，同時(shí)設(shè)立ATF5表達(dá)缺失組及對(duì)照組。觀察注射部位直至成瘤，記錄裸鼠出瘤的時(shí)間、腫瘤的大小，觀察移植瘤

7、的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，計(jì)算活體移植瘤的體積。終止實(shí)驗(yàn)時(shí)，取一部分移植瘤Western-blot技術(shù)檢測(cè)ATF5表達(dá)變化及乙?；?。
　　結(jié)果:
　　1.53例腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤和5例非腫瘤組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示，HCMVIE和ATF5在間變性膠質(zhì)瘤(anaplastic gliomas，AG)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GM)和低級(jí)星形細(xì)胞瘤(low-grade gliomas，LGG)中

8、的表達(dá)水平明顯高于非腫瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;HCMV IE陽性率與ATF5表達(dá)成明顯正相關(guān)關(guān)系（r-0.810，P＜0.01）。
　　2.ATF5在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中高表達(dá)，培養(yǎng)液血清缺失，會(huì)抑制U87細(xì)胞的增殖，引起鏡下可見的細(xì)胞皺縮凋亡。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，HCMV感染和IE86過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的增殖;流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)顯示，IE86過表達(dá)可幫助細(xì)胞抵抗血清缺失引起的細(xì)胞凋亡。而對(duì)于ATF5表達(dá)抑制組，HCMV感染及

9、IE86過表達(dá)則不會(huì)使U87細(xì)胞抵抗血清缺失引起的細(xì)胞凋亡。
　　3.qRT-PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)液血清缺失會(huì)下調(diào)ATF5的表達(dá)，而HCMV感染及IE86過表達(dá)，會(huì)促進(jìn)ATF5及其下游基因的表達(dá)。
　　4.免疫熒光結(jié)果顯示，IE86蛋白和ATF5在U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)共定位于細(xì)胞核;免疫共沉淀結(jié)果顯示IE86與內(nèi)源性ATF5存在相互作用;通過ATF5蛋白氨基端缺失負(fù)顯性抑制載體研究發(fā)現(xiàn)，IE86與

10、ATF5的結(jié)合依賴于其氨基端脯氨酸富集的區(qū)域。
　　5.免疫共沉淀及western blot結(jié)果顯示，血清饑餓48h后，ATF5的乙?；较陆担c乙?；竝300的結(jié)合減弱;IE86過表達(dá)會(huì)加強(qiáng)ATF5與p300的結(jié)合，提高ATF5的乙?；剑瑥亩龠M(jìn)細(xì)胞增殖。
　　6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，成功構(gòu)建出膠質(zhì)瘤裸鼠皮下移植瘤動(dòng)物模型。正常U87細(xì)胞中，HCMV IE86過表達(dá)組裸鼠的腫瘤體積增長(zhǎng)速度、腫瘤終體積及重量均明顯高于

11、其他對(duì)照組(p＜0.05)。western blot方法檢測(cè)情況顯示，IE86過表達(dá)組的ATF5表達(dá)水平及乙?；骄黠@高于對(duì)照組(P＜0.05)。在ATF5表達(dá)抑制U87中，HCMV IE86過表達(dá)不會(huì)加速腫瘤生長(zhǎng)，增加腫瘤的終體積。
　　結(jié)論:
　　1.HCMV IE86及ATF5在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，表達(dá)具有相關(guān)性，且與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)程度正相關(guān)。
　　2.HCMV感染及IE86過表達(dá)能在體外增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87的